In vitro and in vivo investigation of the potential of dietary natural bioactives to improve parameters of the gastrointestinal health in weaned pigs and broiler chickens

Abstract

The main research objective of this thesis was to evaluate the potential of candidate dietary supplements, namely casein hydrolysate (CH) and its 5 kDa retentate (5kDaR), yeast β-glucan and crude fucoidan- and laminarin-rich seaweed extracts, to promote growth and gastrointestinal health in weaned pigs with a focus on modulating the composition of the gastrointestinal microbiota. The first three experimental chapters (Chapter 2 - 4) involved an initial assessment of the different dietary candidates for their antibacterial and prebiotic effects using two in vitro GIT microbiota models: 1) a batch fermentation assay inoculated with faeces from weaned pigs, and; 2) a panel of pure culture growth assays with selected beneficial (Lactobacillus plantarum, L. reuteri, Bifidobacterium thermophilum) and pathogenic (Salmonella Typhimurium, enterotoxigenic Escherichia coli) bacterial strains. Chapter 2 focused on CH, 5kDaR and yeast β-glucan and whether CH could substitute 5kDaR, whereas Chapters 3 and 4 investigated how seaweed species, harvest season and extraction methodologies/conditions influenced the antibacterial and prebiotic potential of the whole biomass samples and extracts of Ascophyllum nodosum and Laminaria spp., respectively. During the in vitro assessment of the dietary candidates, an A. nodosum extract (ANE1) produced using the E1 extraction conditions of a novel hydrothermal-assisted extraction (HAE) methodology exhibited a strong antibacterial activity against S. Typhimurium and ETEC and, thus, was selected for further in vivo investigation. In Chapter 5, a new fucoidan-rich A. nodosum extract (ANE) produced using the above-mentioned extraction protocol, was evaluated at two inclusion levels (high and low) as a dietary intervention to control Salmonella infection in naturally infected weaned pigs and improve parameters of gastrointestinal health. ANE exhibited similar in vitro antibacterial activity to the ANE1. High ANE supplementation reduced Salmonella shedding during the post-weaning period; however, no benefits were observed in Salmonella shedding and intestinal colonisation following movement to the grower houses, regrouping and experimental re-infection with S. Typhimurium. High ANE supplementation led to a more beneficial colonic microbiota, characterised by reduced Enterobacteriaceae counts and increased Bifidobacterium spp. counts, and reduced expression of inflammatory markers that facilitate Salmonella colonisation and persistence. Fucoidan was considered the bioactive component, as it was the major constituent of ANE. The second research objective of this thesis was to evaluate the potential of a laminarin-rich extract as a dietary supplement in broiler chickens based on its previous beneficial effects on growth and gastrointestinal health in pigs, as these two animal species share similarities in terms of gastrointestinal ecosystem and production and intestinal challenges. In Chapter 6, dietary supplementation with 300 ppm laminarin improved performance, increased the caecal Bifidobacterium spp. population and enhanced nutrient absorption, intestinal integrity and protective immune responses indicating improved resistance to intestinal pathogens without compromising growth. Overall, seaweed extracts are promising dietary supplements to enhance performance and gastrointestinal health in broiler chickens and, potentially under challenging conditions in pigs, thus, meriting further exploration. Nevertheless, prior in vitro evaluation and purification of the bioactive components are required to improve their efficacy in in vivo conditions.

Το κύριο ερευνητικό αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν να αξιολογηθεί η δυνατότητα των υποψηφίων διατροφικών συμπληρωμάτων, συγκεκριμένα του υδρολύματος καζεΐνης (CH) και του 5 kDa κατακρατήματος (retentate) του (5kDaR), της β-γλυκάνης ζυμομύκητα και των ανεπεξέργαστων εκχυλισμάτων φυκιών πλούσιων σε fucoidan και laminarin (πολυσακχαρίτες), να προάγουν την ανάπτυξη και τη γαστρεντερική υγεία στα απογαλακτισμένα χοιρίδια, εστιάζοντας στις επιδράσεις τους στη σύσταση της εντερικής μικροχλωρίδας. Τα πρώτα τρία πειραματικά κεφάλαια (Κεφάλαιο 2 - 4) περιλάμβαναν μία αρχική αξιολόγηση των διάφορων υποψήφιων διατροφικών συμπληρωμάτων σχετικά με την αντιβακτηριδιακή και πρεβιοτική δράση τους, χρησιμοποιώντας δύο in vitro μοντέλα της εντερικής μικροχλωρίδας: 1) μία δοκιμή ζύμωσης κλειστού συστήματος (batch fermentation) ενoφθαλμισμένη με κοπρανα απογαλακτισμένων χοιριδίων και 2) ενός πάνελ δοκίμων ανάπτυξης καθαρής καλλιέργειας με επιλεγμένα ωφέλιμα (Lactobacillus plantarum, L. reuteri, Bifidobacterium thermophilum) και παθογόνα (Salmonella Typhimurium, enterotoxigenic Escherichia coli) βακτήριακα στελέχη. Το Κεφάλαιο 2 εστίασε στα CH, 5kDaR και β-γλυκάνη ζυμομύκητα και στο αν το CH μπορεί να αντικαταστήσει το 5kDaR, ενώ τα Κεφάλαια 3 και 4 διερεύνησαν πως το είδος του φυκιού, η εποχή περισυλλογής και οι μεθοδολογίες και συνθήκες εκχύλισης επηρεάζουν την πιθανή αντιβακτηριδιακή και πρεβιοτική δράση των φυκιών Ascophyllum nodosum and Laminaria spp. ως συνολική βιομάζα και των εκχυλισμάτων τους, αντίστοιχα. Κατά την in vitro αξιολόγηση των υποψήφιων διατροφικών συμπληρωμάτων, ένα A. nodosum εκχύλισμα (ANE1), παραχθέν χρησιμοποιώντας τις E1 συνθήκες εκχύλισης μιας καινοτόμου μεθοδολογίας υδροθερμικά-βοηθούμενης εκχύλισης (hydrothermal-assisted extraction, HAE), έδειξε μια ισχυρή αντιβακτηριδιακή δράση κατά των S. Typhimurium και ETEC και, επομένως, επιλέχθηκε για περαιτέρω in vivo διερεύνηση. Στο κεφάλαιο 5, ένα καινούργιο πλούσιο σε fucoidan A. nodosum εκχύλισμα (ANE) παραχθέν χρησιμοποιώντας το παραπάνω πρωτόκολλο εκχύλισης, αξιολογήθηκε σε δύο συγκεντρώσεις (υψηλή και χαμηλή) ως διατροφική παρέμβαση για τον έλεγχο της μόλυνσης με σαλμονέλλα σε φυσικά μολυσμένα απογαλακτισμένα χοιρίδια και την βελτίωση παραμέτρων της γαστρεντερικής υγείας. Το ANE έδειξε παρόμοια in vitro αντιβακτηριδιακή δράση με το ANE1. Η χορήγηση της υψηλής συγκέντρωσης ANE μείωσε την εντερική αποβολή σαλμονέλλας κατά την περίοδο μετά τον απογαλακτισμό, χωρίς ωστόσο να παρατηρούνται οφέλη στην εντερική αποβολή σαλμονέλλας και στον εντερικό αποικισμό μετά την μετακίνηση στους θαλάμους προ-πάχυνσης, την ανακατανομή σε ομάδες και την πειραματική επαναμόλυνση με S. Typhimurium. Η χορήγηση της υψηλής συγκέντρωσης ANE οδήγησε σε μια πιο ωφέλιμη μικροχλωρίδα στο παχύ έντερο, που χαρακτηρίζονταν από μειωμένους αριθμούς των Enterobacteriaceae και αυξημένους αριθμούς του Bifidobacterium spp., και σε μειωμένη έκφραση δεικτών φλεγμονής που διευκολύνουν τον αποικισμό και την επίμονη μόλυνση της σαλμονέλλας στο έντερο. Το fucoidan θεωρήθηκε η βιοδραστική ουσία, καθώς αποτελούσε το κύριο συστατικό του ANE. Το δεύτερο ερευνητικό αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν να αξιολογηθεί ένα πλούσιο σε laminarin εκχύλισμα ως διατροφικό συμπλήρωμα για τα κρεοπαραγωγά ορνίθια με βάση τις προηγούμενες ωφέλιμες επιδράσεις στην ανάπτυξη και γαστρεντερική υγεία των χοίρων, καθώς τα δύο αυτά ζωικά είδη παρουσιάζουν ομοιότητες ως προς το γαστρεντερικό τους περιβάλλον, το σύστημα παραγωγής και τις εντερικές προκλήσεις. Στο Κεφάλαιο 6, η χορήγηση 300 ppm laminarin στο σιτηρέσιο βελτίωσε τους δείκτες παραγωγικότητας, αύξησε τον πληθυσμό του Bifidobacterium spp. στα τυφλά και ενίσχυσε την απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών, την ακεραιότητα του εντέρου και τις προστατευτικές ανοσοποιητικές αποκρίσεις, υποδεικνύοντας βελτιωμένη αντίσταση σε παθογόνα χωρίς αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη. Συνολικά, τα εκχυλίσματα φυκιών αποτελούν υποσχόμενα διατροφικά συμπληρώματα για να ενισχύσουν την παραγωγικότητα και την γαστρεντερική υγεία στα κρεοπαραγωγά ορνίθια και ενδεχομένως στους χοίρους κάτω από δύσκολές συνθήκες, αξίζοντας επομένως περαιτέρω διερεύνηση. Παρόλα αυτά, πρέπει να προηγηθούν in vitro αξιολόγηση και καθαρισμός των βιοδραστικών συστατικών για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητά τους στις in vivo συνθήκες.