Antimicrobial resistance and molecular epidemiology of Campylobacter spp. isolated from broiler flocks in southern Greece

Abstract

A cross-sectional study was conducted to estimate the prevalence of and risk factors for Campylobacter spp. colonization of broiler flocks and broiler carcasses contamination in Greek slaughterhouses. Moreover, the antimicrobial susceptibility of Campylobacter isolates derived from both caecal and neck skin samples were tested to 7 antimicrobials, including nalidixic acid, ciprofloxacin, erythromycin, tetracycline, gentamycin, streptomycin and ampicillin. Finally, flaA sequencing was performed for the subtyping of 62 C. jejuni and 58 C. coli strains and phylogenetic trees were constructed using the neighbor-joining method to study their evolutionary relationships.Over a 14-month period, a pool of 10 caeca and 5 neck skin samples from chicken carcasses were collected from each of 142 batches of broiler flocks slaughtered in 3 different slaughterhouses. Information on potential risk factors for Campylobacter infection in broilers was collected by an on-farm interview and linked according to the Campylobacter contamination status of broiler flocks and differences in farm characteristics and management practices identified from questionnaires.Campylobacter spp. was isolated from 73.94% of caeca (95% CI 65.92-80.94) and 70.42% of carcasses (95% CI 62.19-77.78), respectively. A significant correlation (p < 0.001) between the presence of Campylobacter spp. in broiler caeca and contamination of carcasses was found, suggesting the spread of the microorganism on the skin of carcasses during the slaughtering procedure. Two different species of Campylobacter (C. jejuni, C. coli) were recovered, while C. coli was found to be the predominant species identified both in caecal and neck skin samples.A multiple logistic regression showed the disinfection of the poultry house being conducted by unskilled personnel (odds ratio [OR] 1⁄4 = 3.983) as a significant risk factor (p < 0.05) and the use of straw litter as bedding material (OR 1⁄4 = 0.170) and closure of windows during the intervals of production cycles (OR 1⁄4 = 0.396) as significant protective factors (p < 0.05) for broiler flock contamination.A total of 98.5% of the strains were resistant to at least one antimicrobial agent. In terms of multidrug resistance, 11.7% of strains were resistant to three or more groups of antimicrobials. Extremely high resistance to fluoroquinolones (89%), very high resistance to tetracycline (69%) and low resistance to macrolides (7%) was detected.No prevalence of a specific flaA type was observed indicating the genetic diversity of the isolates, while some flaA types were found to share similar antimicrobial resistance patterns. Seven clusters of the C. jejuni phylogenetic tree and three clusters of the C. coli tree were considered significant with bootstrap values > 75%. Some isolates clustered together were originated from the same or adjacent farms, indicating transmission via personnel or shared equipment. These results are important and help further the understanding of the molecular epidemiology and antimicrobial resistance of Campylobacter spp. derived from poultry in Greece.

Μια διατμηματική μελέτη πραγματοποιήθηκε για να υπολογιστεί ο επιπολασμός και οι παράγοντες επικινδυνότητας της μόλυνσης των σμηνών κρεοπαραγωγής και των σφαγίων τους με Campylobacter spp. στα πτηνοσφαγεία της Ελλάδας. Επιπλέον, ελέγχθηκε η αντιμικροβιακή αντοχή των απομονωθέντων στελεχών Campylobacter από το περιεχόμενο των τυφλών εντέρων και του δέρματος του λαιμού σε 7 αντιμικροβιακούς παράγοντες (ναλιδιξικό οξύ, σιπροφλοξασίνη, ερυθρομυκίνη, τετρακυκλίνη, γενταμυκίνη, στρεπτομυκίνη και αμπικιλλίνη). Τέλος, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση του γoνιδίου flaA για την υποτυποποίηση 62 στελεχών C. jejuni και 58 στελεχών C. coli και κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο σύνδεσης γειτόνων για να μελετηθούν οι εξελικτικές τους σχέσεις.Για μια περίοδο 14 μηνών, πραγματοποιήθηκε σειρά δειγματοληψιών 10 τυφλών εντέρων και 5 δερμάτων λαιμού από σφάγια ορνιθίων κρεοπαραγωγής για κάθε μία από τις 142 παρτίδες που σφάχτηκαν σε 3 διαφορετικά σφαγεία. Ακολούθησε συλλογή πληροφοριών σχετικά με τους πιθανούς παράγοντες επικινδυνότητας για τη μόλυνση των ορνιθίων κρεοπαραγωγής με Campylobacter ύστερα από συνέντευξη που έλαβε χώρα στις πτηνοτροφικές μονάδες από τις οποίες προέρχονταν τα πουλερικά με τη χρήση ειδικά σχεδιασμένου ερωτηματολογίου, και αυτά τα δεδομένα συσχετίστηκαν με την παρουσία Campylobacter στα σμήνη κρεοπαραγωγής και τις διαφορές στα χαρακτηριστικά των εκτροφών και τις διαχειριστικές πρακτικές που ακολουθούνταν.Aπομονώθηκαν Campylobacter spp. από το 73.94% των τυφλών (95% ΔΕ 65.92-80.94) και το 70.42% των δερμάτων λαιμού (95% ΔΕ 62.19-77.78), αντίστοιχα. Βρέθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση (p < 0.001) μεταξύ της παρουσίας των Campylobacter spp. στα τυφλά και τη μόλυνση του δέρματος των σφαγίων, υποδεικνύοντας τη διάδοση του μικροοργανισμού στο δέρμα των σφαγίων κατά τη διαδικασία της σφαγής. Δύο διαφορετικά είδη Campylobacter (C. jejuni, C. coli) ανακτήθηκαν, ενώ το C. coli ήταν το επικρατέστερο είδος που εντοπίστηκε τόσο στα τυφλά όσο και στα δείγματα δέρματος λαιμού.Μια πολλαπλή ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι η απολύμανση των υποστατικών από μη εξειδικευμένο προσωπικό (OR 1⁄4 = 3.983) αποτελεί στατιστικώς σημαντικό παράγοντα επικινδυνότητας (p < 0.05) , ενώ η χρήση αχύρου ως στρωμνή (OR 1⁄4 = 0.170) και το κλείσιμο των παραθύρων κατά τη διάρκεια του υγειονομικού κενού μεταξύ των παραγωγικών κύκλων (OR 1⁄4 = 0.396) αποτελούν στατιστικώς σημαντικούς προστατευτικούς παράγοντες (p < 0.05) για τη μόλυνση των σμηνών κρεοπαραγωγής με Campylobacter.Συνολικά 98.5% των απομονωθέντων στελεχών βρέθηκαν ανθεκτικοί σε τουλάχιστον έναν αντιμικροβιακό παράγοντα. Όσον αφορά την πολυανθεκτικότητα, 11.7% των στελεχών βρέθηκαν ανθεκτικά σε τρεις ή περισσότερες ομάδες αντιμικροβιακών. Ανιχνεύθηκε εξαιρετικά υψηλή αντοχή στις φλουοροκινολόνες (89%), πολύ υψηλή αντοχή στην τετρακυκλίνη (69%) και χαμηλή αντοχή στα μακρολίδια (7%).Δεν παρατηρήθηκε επικράτηση συγκεκριμένου τύπου flaA, γεγονός που υποδεικνύει τη γενετική ποικιλομορφία των απομονωθέντων στελεχών, ενώ ορισμένοι τύποι flaA βρέθηκαν να παρουσιάζουν παρόμοιο προφίλ αντιμικροβιακής αντοχής. Επτά ομάδες (clusters) στο φυλογενετικό δέντρο των C. jejuni και τρεις ομάδες στο δέντρο των C. coli θεωρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές με τιμές bootstrap > 75%. Ορισμένα στελέχη που ομαδοποιήθηκαν μαζί βρέθηκε ότι προέρχονταν από την ίδια ή παρακείμενες εκτροφές, γεγονός που υποδεικνύει μετάδοση μέσω του εργατικού προσωπικού της εκτροφής ή του κοινόχρηστου εξοπλισμού. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σημαντικά και βοηθούν στην περαιτέρω κατανόηση της μοριακής επιδημιολογίας και της αντιμικροβιακής αντοχής των Campylobacter spp. που προέρχονται από την πτηνοτροφία στην Ελλάδα.