Μελέτη του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 καθώς και της υπεροικογένειας της Geminin στην πρόκληση γονιδιωματικής αστάθειας και στον καθορισμό της κυτταρικής μοίρας

Abstract

Genome stability is mainly preserved through normal progression of the cell cycle and regulation of DNA replication in time and space. From late mitosis and during G1, pre- replicative complexes are formed in chromatin, establishing the origins of replication, which will fire in the subsequent S phase. Pre-replicative complexes are formed through recruitment of MCM2-7 through corporation of ORC1-6, CDT1 and CDC6. Deregulated expression of CDT1 and CDC6 induces re-replication, replication stress and DNA damage. Gene amplification is a type of genomic instability, which leads to oncogene activation and acquired drug resistance. Here, we studied whether re-replication is a potent inducer of gene copy number increase. CDT1 and CDC6 overexpression promoted DHFR gene duplication and induced resistance to methotrexate. ATM/ATR checkpoint activation was required for re-replication induced gene amplification. Multiple repair pathways were activated upon re-replication induction. RAD52 dependent repair participated in resolution of re-replication intermediates to generate DHFR duplications, a process inhibited by 53BP1. Cells lacking RAD52 and overexpressing CDT1 and CDC6 showed exacerbated DNA damage, abnormal chromosome segregation and cell death. Overall, re-replication is a novel mechanism of gene copy number gain formation. Overexpression of CDT1 or Geminin depletion promotes origin re- licensing and re-firing, formation of double strand breaks and apoptosis. Here, we examined the anti-cancer potential of small chemical compounds targeting CDT1/Geminin protein-protein interaction. The small chemical compounds tested here showed efficient inhibition/disruption of CDT1-Geminin protein complex in cancer cells. Chemical compound #1 induced double strand breaks, inhibition of DNA synthesis and S/G2 cell cycle arrest, in a dose dependent manner, phenocopying CDT1 overexpression or Geminin depletion. Moreover, chemical compound #1 promoted cancer cell death without affecting normal cell proliferation. CDT1 and Geminin abnormal expression has been reported to participate in cancer development and progression either as oncogenes or as proliferation markers. In order to delineate Cdt1 and Geminin role in cancer we performed chemical induced carcinogenesis in the murine colon. Mice overexpressing Cdt1 and/or lacking Geminin developed a higher number of tumors with bigger size compared to control mice. Tumors overexpressing CDT1 and/or lacking Geminin harbored increased DNA damage and showed aggressive characteristics. Increased origin licensing was observed in tumors and intestinal crypts of mice overexpressing CDT1 and lacking Geminin. Therefore, deregulation of Cdt1 and Geminin expression may enhance colorectal carcinogenesis though aberrant origin licensing in vivo. Overall, we identified that DNA re- replication promotes gene copy number gains, a process which evokes proliferative advantage to cells. Moreover, we studied the specificity of small chemical compounds targeting CDT1/Geminin protein-protein interaction, their mechanism of action as well as their anticancer potential. In the last part of the thesis, we showed that Cdt1 overexpression and/or Geminin depletion participates in colorectal cancer progression through deregulation of the origin licensing program.

Η ομαλή πρόοδος του κυτταρικού κύκλου και η χωρο-χρονική ρύθμιση της αντιγραφής εξασφαλίζουν την διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Από το τέλος της μίτωσης και σε όλη την διάρκεια της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου, πραγματοποιείται η συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων τα οποία καθορίζουν τις θέσεις έναρξης της αντιγραφής, οι οποίες θα πυροδοτηθούν στην S φάση. Η συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων πραγματοποιείται μέσω στρατολόγησης μορίων MCM2-7 στη χρωματίνη μέσω της συνεργασίας των παραγόντων ORC1-6, CDT1 και CDC6. Απορρύθμιση της έκφρασης των CDT1 και CDC6 έχει δειχθεί ότι επάγει επαναντιγραφή, αντιγραφικό στρες και βλάβες στο DNA, διαδικασία που έχει συσχετιστεί με την καρκινική εξαλλαγή των κυττάρων. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί ένα τύπο γονιδιωματικής αστάθειας που εμφανίζεται συχνά σε διαφορετικούς καρκίνους και συμβάλλει στην ενεργοποίηση ογκογονιδίων και απόκτηση ανθεκτικότητας σε αντικαρκινικές θεραπείες. Στην συγκεκριμένη διατριβή, μελετήσαμε την πιθανή συμμετοχή της επαναντιγραφής του DNA στην πρόκληση γονιδιακής ενίσχυσης. Υπερέκφραση των παραγόντων CDT1 και CDC6 οδήγησε σε διπλασιασμούς του γονιδίου DHFR σε καρκινικά κύτταρα καθώς και στην απόκτηση ανθεκτικότητας στο αντικαρκινικό φάρμακο μεθοτρεξάτη. Παράλληλα, δείχθηκε ότι η διαδικασία αυτή απαιτεί την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου μέσω των κινασών ATR/ATM, το οποίο είναι απαραίτητο για την καθοδική σηματοδότηση μονοπατιών επιδιόρθωσης. Οι βλάβες που προκλήθηκαν έπειτα από επαναντιγραφή του DNA οδήγησαν σε ενεργοποίηση διαφορετικών μονοπατιών επιδιόρθωσης, από τα οποία τα εξαρτώμενα από τον παράγοντα RAD52 φάνηκαν να συμμετέχουν σε μεγαλύτερο βαθμό. Ο παράγοντας RAD52 δείχθηκε ότι είναι απαραίτητος για τον διπλασιασμό του γονιδίου DHFR έπειτα από υπερέκφραση των CDT1 και CDC6, με τον παράγοντα 53BP1 να δρα ανασταλτικά. Παράλληλα, κύτταρα που έφεραν υπερέκφραση των CDT1 και CDC6 και απουσία του RAD52, εμφάνισαν εκτεταμένες βλάβες στο γενετικό υλικό, ανωμαλίες κατά τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και κυτταρικό θάνατο. Επομένως, δείχθηκε ότι η επαναντιγραφή του DNA αποτελεί ένα μηχανισμό πρόκλησης γονιδιωματικής αστάθειας ο οποίος μπορεί να συμβάλλει στην επιλογή κυτταρικών κλώνων με εξελικτικό πλεονέκτημα. Υπερέκφραση του CDT1 είτε αποσιώπηση της Geminin οδηγεί σε επαναδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA, πρόκληση διπλών θραύσεων και κυτταρικό θάνατο. Σύμφωνα με αυτά τα δεδομένα, ελέγξαμε την πιθανή αντικαρκινική δράση μικρών συνθετικών χημικών ενώσεων οι οποίες αναστέλλουν/παρεμποδίζουν την αλληλεπίδραση των CDT1/Geminin. Πειράματα ελέγχου της αλληλεπίδρασης των CDT1/Geminin σε καρκινικά κύτταρα παρουσία των συνθετικών χημικών ενώσεων έδειξαν αποτελεσματική αναστολή της αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών. Παράλληλα, επώαση διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών σειρών με τη συνθετική χημική ένωση #1 οδήγησε σε πρόκληση διπλών θραύσεων, παύση της αντιγραφής και του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις S/G2, φαινότυπος που προσομοιάζει την υπερέκφραση του CDT1 ή την αναστολή της Geminin. Παράλληλα, η συνθετική χημική ένωση #1 προκάλεσε αυξημένο κυτταρικό θάνατο σε καρκινικές σειρές σε αντίθεση με φυσιολογικές κυτταρικές σειρές αναδεικνύοντας την πιθανή αντικαρκινική της δράση. Η απορρύθμιση της έκφρασης των πρωτεϊνών CDT1 και Geminin έχει συσχετιστεί με την καρκινική εξαλλαγή των κυττάρων. Παράλληλα, οι πρωτεΐνες CDT1 και Geminin έχουν προταθεί ως δείκτες πολλαπλασιασμού σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Παρόλα αυτά, ο ρόλος των CDT1 και Geminin δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin ενισχύει την καρκινογένεση του παχέος εντέρου παρουσία χημικών μεταλλαξιγόνων. Παράλληλα, οι καρκινικοί όγκοι που έφεραν υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin παρουσίασαν αυξημένες βλάβες στο γενετικό υλικό. Επιπλέον, τόσο στους όγκους του παχέος εντέρου όσο και σε κρύπτες από το παρακείμενο φυσιολογικό επιθήλιο παρατηρήθηκε αυξημένη στρατολόγηση μορίων Mcm2 στους διαγονιδιακούς μύες που έφεραν υπερέκφραση του Cdt1 ή/και απαλοιφή της Geminin. Επομένως, η απορρύθμιση της έκφρασης των Cdt1 και Geminin συμβάλλει στην εξέλιξη της καρκινογένεσης πιθανότατα μέσω αύξησης της αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διατριβής δείχθηκε ότι η επαναντιγραφή του DNA συμβάλλει στην πρόκληση γονιδιακών διπλασιασμών, διαδικασία που προωθεί την απόκτηση εξελικτικού πλεονεκτήματος στα κύτταρα. Στο δεύτερο μέρος, μελετήθηκε η ειδικότητα συνθετικών χημικών ενώσεων ως προς την αναστολή/παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασης των CDT1/Geminin σε ευκαρυωτικά κύτταρα, ο μηχανισμός δράσης τους καθώς και η πιθανή αντικαρκινική τους δράση. Τέλος, στο τρίτο μέρος της διατριβής, δείχθηκε ότι η υπερέκφραση του Cdt1 και η απαλοιφή της Geminin προάγουν την καρκινογένεση του παχέος εντέρου μέσω απορρύθμισης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA.