In vivo και ex vivo γονιδιακή θεραπεία της θαλασσαιμίας με χρήση ενός αδενο-ιικού φορέα γ-σφαιρίνης

Abstract

To overcome the cost and complexity of the current thalassemia ex vivo gene therapy protocols, we developed a minimally invasive and readily translatable approach for in vivo HSC gene delivery which abrogates the need for HSC leukapheresis, CD34+ cell selection, ex vivo HSC culture, myeloablation and ultimately, transplantation. Our approach involves HSC mobilization with G-CSF/AMD3100 and intravenous injections of a hybrid vector system consisting of a CD46-targeting, helper-dependent adenoviral vector, and the hyperactive Sleeping Beauty transposase (SB100x) that mediates integration of the vector-encoded γ-globin and mgmtP140K genes. Transduced HSCs home back to the bone marrow where they persist long-term. We tested our approach in a mouse model recapitulating the phenotype of human β-thalassemia intermedia (CD46+/+/Hbbth-3 mice). At week 8 post in vivo transduction, a 4-dose O6BG/BCNU treatment was administered in order to in vivo select for gene corrected hematopoietic progenitors, thus recovering the HbF expression in 76.0±5.7% of the circulating erythrocytes, by week 29 post in vivo transduction. Hematological parameters at week 29 post in vivo transduction, were significantly improved over baseline or were indistinguishable from normal values, suggesting near to complete phenotypic correction. Treated mice showed significant reduction of spleen size, extramedullary erythropoiesis and parenchymal hemosiderosis. Safety was demonstrated by the good tolerability of treatment, the absence of alterations in hematopoiesis, the normal colony-forming potential of bone marrow cells and the random integration pattern of our vector system. Elevated production of fetal hemoglobin (HbF) throughout adult life, a benign condition known as Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH), has been shown to ameliorate the clinical phenotype of β-thalassemia. Recently, genome editing approaches led to new therapeutic opportunities, enabling specific reactivation of HbF. Here, we developed a helper-dependent adenoviral (HDAd5/35++) vector, tropic to HSCs via CD46, to reactivate the expression of γ-globin by in vivo gene editing of mobilized HSCs, using a CRISPR/Cas9 system to simultaneously disrupt both the binding sites of the gamma globin suppressor BCL11A within HBG1 and HBG2 promoters and the erythroid BCL11A enhancer (HDAd-CRISPR-Dual). To test our hypothesis, for the first time, we generated a xenografted thalassemic mouse model, by transplanting to NBSGW mice CD34+ cells from thalassemic patients to establish human thalassemic hemopoiesis. Six weeks post transplantation, HSPCs from the chimeric murine bone marrow were successfully mobilized to the periphery by administration of G-CSF (250μg/kg for 6 days) and Plerixafor (50μg/kg for 4 days). Forty minutes after the last dose of plerixafor the mice were intravenously injected with the HDAd-CRISPR-Dual vector allowing selective transduction of the human HSCs, as CD46 is not expressed on mouse HSCs. No cytotoxic effects were observed in CD34+ thalassemic cells post ex vivo or in vivo dual editing by HDAd-CRISPR-Dual vector. Importantly, dual-editing led to significantly enhanced HbF-expressing erythroid cells both in vitro and in vivo, which resulted in an improved erythroid lineage maturation profile in vivo, reduced ROS levels and reduced spleen size. Finally, no chromosomal rearrangements were detected by G-banding karyotyping in double-edited cells during erythroid differentiation, indicating that large genomic translocations did not occur between the two edited sites. Overall, we present a simplified platform for gene therapy of thalassemia, which can serve as a cost-efficient and “portable” approach to make gene therapy accessible even to resource-poor regions where thalassemia major is endemic but only minimally complex strategies could be adopted.

Τα τρέχοντα πρωτόκολλα για τη γονιδιακή θεραπεία της θαλασσαιμίας περιλαμβάνουν τη συλλογή των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSPCs) από τους ασθενείς, την in vitro καλλιέργεια και διαμόλυνσή τους με λεντι-ιικούς φορείς και τέλος τη μεταμόσχευση των γενετικά τροποποιημένων HSPCs στους μυελοκατασταλμένους ασθενείς. Το αυξημένο κόστος και η πολυπλοκότητα της μεθόδου, δυσχεραίνουν την εφαρμογή τέτοιων πρωτοκόλλων στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου η ανάγκη για θεραπεία της β-θαλασσαιμίας είναι τεράστια. Αναπτύχθηκε μια απλοποιημένη και ελάχιστα επεμβατική μέθοδος in vivo γονιδιακής θεραπείας, που περιλαμβάνει την κινητοποίηση των HSPCs από τον μυελό των οστών στην περιφέρεια του αίματος και την ενδοφλέβια έγχυση ενός υβριδικού, εξαρτώμενου συστήματος αδενο-ιικών φορέων (HDAd5/35++) και της Sleeping Beauty τρανσποζάσης (SB100X), που στοχεύει τον υποδοχέα CD46 του ανθρώπου, τροποποιώντας τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (HSCs) στην περιφέρεια. Τα γενετικά πλέον διορθωμένα κύτταρα, επιστρέφουν από την περιφέρεια του αίματος, όπου έγινε η διαμόλυνση, πίσω στο μυελό των οστών, όπου και παραμένουν μακροπρόθεσμα. H προσέγγιση αυτή ελέγχθηκε σε ένα ζωικό μοντέλο ποντικού που προσομοιάζει το φαινότυπο της ενδιάμεσης β-θαλασσαιμίας του ανθρώπου (CD46+/+/Hbbth-3). Οχτώ εβδομάδες μετά την in vivo γενετική τροποποίηση, χορηγήθηκε θεραπεία 4 δόσεων με χημειοτακτικούς παράγοντες (O6BG/BCNU) για την in vivo επιλογή των γενετικά διορθωμένων HSCs, αυξάνοντας την έκφραση της γ σφαιρίνης στο 76,0±5,7% των κυκλοφορούντων ερυθροκυττάρων, την εβδομάδα 29 μετά την in vivo γενετική τροποποίηση. Οι αιματολογικές παράμετροι βελτιώθηκαν σημαντικά, σε σημείο που δεν διακρίνονταν από τις φυσιολογικές τιμές, υποδηλώνοντας σχεδόν πλήρη φαινοτυπική διόρθωση. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία εμφάνισαν σημαντική μείωση α) στο μεγέθους του σπλήνα, β) στην εξωμυελική ερυθροποίηση και γ) στην παρεγχυματική αιμοσιδήρωση. Η ασφάλεια αποδείχθηκε από την καλή ανεκτικότητα της θεραπείας, την απουσία αλλαγών στην αιμοποίηση, τη φυσιολογική κλωνογενή ικανότητα των κυττάρων του μυελού των οστών και το πρότυπο τυχαίας ενσωμάτωσης του φορέα. Η αυξημένη παραγωγή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) κατά την ενήλικη ζωή, μια καλοήθης κατάσταση γνωστή ως Κληρονομική Παραμονή της Εμβρυϊκής Αιμοσφαιρίνης (HPFH), έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει τον κλινικό φαινότυπο της β-θαλασσαιμίας. Πρόσφατα, οι προσεγγίσεις επεξεργασίας γονιδιώματος (gene editing) οδήγησαν στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, επιτρέποντας τη στοχευμένη επανενεργοποίηση της HbF. Αναπτύχθηκε ένα σύστημα εξαρτώμενων, αδενοϊικών φορέων (HDAd5/35++), που στοχεύει τα HSCs μέσω του υποδοχέα CD46, με σκοπό την επανενεργοποίηση της έκφρασης της HbF. Αποτελείται από ένα σύστημα CRISPR/Cas9 για την ταυτόχρονη στόχευση, του ερυθροειδικού ενισχυτή του καταστολέα της HbF (BCL11A) και ταυτόχρονα της περιοχής πρόσδεσής του, στους υποκινητές HBG1/HBG2 της HbF (ΗDAd-CRISPR-Dual). Για τον έλεγχο αυτής της προσέγγισης, δημιουργήσαμε ένα θαλασσαιμικό ζωικό μοντέλο ξενομεταμόσχευσης, μεταμοσχεύοντας σε ποντίκια NBSGW, CD34+ κύτταρα από ασθενείς με β-θαλασσαιμία για να εδραιωθεί θαλασσαιμική αιμοποίηση, παρόμοια με του ανθρώπου. Έξι εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση, τα HSCs από το χιμαιρικό μυελό των οστών ποντικού κινητοποιήθηκαν επιτυχώς στην περιφέρεια μετά από χορήγηση G-CSF (250 μg/kg για 6 ημέρες) και Plerixafor (50 μg/kg για 4 ημέρες). Σαράντα λεπτά μετά την τελευταία δόση του Plerixafor, εγχύθηκε ενδοφλεβίως ο φορέας HDAd-CRISPR-Dual, που επιτρέπει την επιλεκτική in vivo γενετική τροποποίηση των HSCs του ανθρώπου, καθώς ο υποδοχέας CD46 δεν εκφράζεται στα HSCs του ποντικού. H ταυτόχρονη γενετική τροποποίηση των περιοχών BCL11A και HBG1/2, δεν αποδείχθηκε τοξική για τα θαλασσαιμικά CD34+ κύτταρα, ενώ τόσο in vitro, όσο και in vivo παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της HbF, που οδήγησε σε βελτίωση της ερυθροποίησης. Ένα πιθανό θέμα ασφάλειας όταν προκαλείται διπλό ρήγμα, καθώς στοχεύονται διπλές θέσεις στο γονιδίωμα ή/και περιοχές με σημαντική ομολογία μεταξύ τους, είναι οι χρωμοσωμικές αναδιατάξεις. Για το λόγο αυτό έγινε καρυοτυπική ανάλυση, η οποία σημαντικά, δεν κατέδειξε χρωμοσωμικές αναδιατάξεις ή/και απαλοιφές σε (τουλάχιστον) 20 μεταφάσεις που μελετήθηκαν, σε όλα τα δείγματα των ασθενών. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή προτείνεται μια οικονομική και εύκολα μεταφράσιμη μέθοδο, η οποία καταργεί την ανάγκη λευκαφαίρεσης, μυελοκαταστολής και εξειδικευμένης εμπειρίας και μπορεί να οδηγήσει σε μια ευρύτερη κλινική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας της θαλασσαιμίας.