Αντι-ιικά Τ-λεμφοκύτταρα με ανθεκτικότητα στα γλυκοκορτικοειδή μέσω CRISPR/Cas9 γονιδιακής επεξεργασίας, για τη θεραπεία ιογενών λοιμώξεων μετά από αλλογενή μεταμόσχευση

Abstract

Viral and fungal infections are among the most fatal complications in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). While pharmacotherapy often fails or is associated with toxicity, adoptive immunotherapy (AI) with pathogen-specific T cells (pSTs) represents an attractive alternative. However, T cells perform suboptimally under immunosuppression, mainly steroids like Dexamethasone (Dex), which represent the first-line treatment of transplant-associated immunological complications, thus clinical implementation of AI is limited to patients not receiving high-dose steroids, a prerequisite for optimal T-cell function. The latter generates the obvious paradox of depriving the most susceptible to infections patients of the potential benefits of AI. To address this issue, in this study we aimed to i) evaluate the impact of Dexamethasone (Dex) on primary, activated, human T cells, ii) develop a CRISPR/Cas9 system to genetically disrupt the glucocorticoid receptor (GR) in lymphocytes, ultimately aiming to generate steroid-resistant pSTs and iii) develop a CRISPR/dCas9 system for epigenetic editing of the GR gene. Initially, proliferation, apoptosis and immunophenotype of human T cells were evaluated upon stimulation with CD3/CD80 and culture in the presence or absence of Dex. A 3-day exposure to Dex impaired the proliferation of CD3/CD80-pulsed primary T cells and induced early apoptosis over the “no Dex” condition. Immunophenotypically, Dex also increased T-regulatory cells (CD4+/CD25high) and upregulated the major T-cell exhaustion markers PD-1 and CTLA-4, over the “no Dex” condition. To inactivate the GR gene, we designed8 guide RNAs (sgRNAs) to target different genomic sequences corresponding to various domains of the GR (a transcription start site, and exons 2, 3, 4 and 5) and cloned them in plasmids with the Cas9 genes. Subsequently we generated lenti-viral vectors encoding the gRNAs and used them to transduce T2 lymphocytic cell line. After selection in culture supplemented with the appropriate antibiotic, transduced T2 cells were incubated in the presence or absence of Dex and their proliferation and GR disruption were evaluated. Cells transduced with a viral vector expressing Cas9 but no gRNA(empty vector) were used as negative control. Based on these results, the optimum sgRNA was selected for further use in T-cells. Subsequently, we generated a steroid-resistant T-cell product, simultaneously targeting 4 viruses [adenovirus, cytomegalovirus, Epstein Barr virus and BK virus] and the fungus Aspergillus fumigatus, by genetic disruption of the glucocorticoid receptor (GR) gene using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein delivery of the sgRNA selected previously. Following efficient on-target GR disruption and minimal off-target editing, the generated T cell product maintained the characteristics of pentavalent-STs, their unedited counterparts, including polyclonality, memory immunophenotype, specificity and cytotoxicity while they presented functional resistance to dexamethasone. Taking a step forward, we used a CRISPR/dCas9 system to epigenetically edit T2 cells with a sgRNApool and two different suppressors, DNMT3A methyltransferase and KRAB. T2 cells transduced with DNMT3A and sgRNA pool presented better proliferation rates ±Dex as contrasted to the empty-transduced cells, suggesting that pool contained sgRNAs which functionally disrupted GR. Overall, we confirm the inhibitory effect of Dex on primary T cells and provide an effective protocol to CRISPR/Cas9-disrupt the GR and confer resistance of T-cells to steroids. By this approach, we endeavor to ultimately offer the benefits of AI to the patients most vulnerable to infections, as those who receive high-dose steroids post allo-HSCT.

Οι ευκαιριακές λοιμώξεις ασθενών μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρωνεπηρεάζουν δυσμενώς την έκβαση των μεταμοσχεύσεων. Η συμβατική φαρμακοθεραπεία συχνά αποτυγχάνει, ενώ συνοδεύεται από τοξικότητα, σημαντικό κόστος και ανάπτυξη αντοχής. Εναλλακτικά, η υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία (ΥΑ) με αντι-ιικά Τ‐λεμφοκύτταρα (virus-specific Tcells- VSTs) προτείνεται ως αποτελεσματική θεραπεία των λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Μολονότι υπάρχουν απλοποιημένα πρωτόκολλα ΥΑ με ταυτόχρονη στόχευση πολλών ιών, η αναστολή της δράσης των VSTs παρουσία υψηλών δόσεων γλυκοκορτικοειδών παραμένει ένας σημαντικός περιορισμός. Η σημασία του συγκεκριμένου περιορισμού είναι προφανής, καθώς οι ασθενείς με νόσο μοσχεύματος κατά ξενιστή (GvHD) που λαμβάνουν υψηλές δόσεις γλυκοκορτικοειδών είναι και οι περισσότερο ευπαθείς σε σοβαρές ευκαιριακές λοιμώξεις.Αρχικός στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης της δεξαμεθαζόνης (Dex) στα πρωτογενή, ενεργοποιημένα ανθρώπινα Τ λεμφοκύτταρα. Ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και ο ανοσοφαινότυπος των ανθρώπινων Τ κυττάρων αξιολογήθηκαν μετά από διέγερση με CD3/CD80 και καλλιέργεια παρουσία ή απουσία Dex. Η τριήμερη έκθεση στη Dex μείωσε τον πολλαπλασιασμό των πρωτογενών Τ κυττάρων και τα οδήγησε σε πρώιμη απόπτωση συγκριτικά με αυτά που καλλιεργήθηκαν απουσία Dex. Ανοσοφαινοτυπικά, η Dex αύξησε τα Τ-ρυθμιστικά κύτταρα (CD4+/CD25 high) και οδήγησε σε υψηλά επίπεδα τους δείκτες εξουθένωσης των Τκυττάρων PD-1 και CTLA-4.Επόμενος στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός συστήματος CRISPR/Cas9 για τη γενετική αδρανοποίηση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR) στα λεμφοκύτταρα, στοχεύοντας τελικά στη δημιουργία αντιγονο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων (pathogen-specific T-cells, pSTs) ανθεκτικών στα στεροειδή. Για να απενεργοποιήσουμε το γονίδιο GR, σχεδιάσαμε 8 RNA-οδηγούς (sgRNA) που στοχεύουν διαφορετικές γονιδιωματικές αλληλουχίες του (θέση έναρξης μεταγραφής και εξόνια 2, 3, 4 και 5) και τα κλωνοποιήσαμε σε πλασμίδια που εκφράζουν το γονίδιο της Cas9. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε λεντι-ϊικούς φορείς που κωδικοποιούν τα sgRNA και τους χρησιμοποιήσαμε για τη διαμόλυνση κυττάρων Τ2. Μετά από επιλογή σε καλλιέργεια με το κατάλληλο αντιβιοτικό, τα τροποποιημένα κύτταρα Τ2 επωάστηκαν παρουσία ή απουσία Dex και αξιολογήθηκαν ο πολλαπλασιασμός τους και η διάσπαση του GR. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, επιλέχθηκε το βέλτιστο sgRNA για περαιτέρω χρήση σε Τ-λεμφοκύτταρα. Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε ένα προϊόν Τ‐λεμφοκυττάρων ειδικών έναντι 5 παθογόνων [ιού Epstein‐Barr, κυτταρομεγαλοϊού, αδενοϊού, polyomavirustypeI-BK, και του μύκητα Aspergillusfumigatus] και ταυτόχρονα, ανθεκτικών στα γλυκοκορτικοειδή με γενετική τροποποίηση του γονιδίου του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, με τη χρήση του sgRNA που επιλέχθηκε προηγουμένως. Μετά από αποτελεσματική εντός-στόχου διάσπαση τουGR και ελάχιστη εκτός-στόχου δράση, τα Τ-λεμφοκύτταρα αυτά διατήρησαν τα χαρακτηριστικά των μη επεξεργασμένων ομολόγων τους, όπως πολυκλωνικότητα, δείκτες μνήμης, ειδικότητα και κυτταροτοξικότητα, ενώ παρέμειναν λειτουργικά παρουσίαDex. Κάνοντας ένα βήμα παραπάνω, με στόχο την επιγενετική αποσιώπηση του υποδοχέα GR, προκειμένου να αποφευχθεί η μόνιμη τροποποίηση του γονιδιώματος, στη συνέχεια αναπτύξαμε ένα σύστημα CRISPR/dCas9. Χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα CRISPR/dCas9 για να τροποποιήσουμε αυτήν τη φορά επιγενετικά Τ2 κύτταρα με ένα μίγμα7 sgRNAs και δύο διαφορετικούς καταστολείς, τη μεθυλοτρανσφεράση DNMT3A και τον KRAB. Τα Τ2 κύτταρα που έφεραν την DNMT3A παρουσίασαν σημαντικά μικρότερη αναστολή του πολλαπλασιασμού τους παρουσία Dex σε σύγκριση με τα κύτταρα της ομάδας αναφοράς, υποδηλώνοντας ότι επιτυχή μεταγραφική καταστολή του GR με τον epieditor DNMT3A. Συνολικά, επιβεβαιώνεται η ανασταλτική δράση τηςDex στα πρωτογενή Τ λεμφοκύτταρα και προτείνεται ένα αποτελεσματικό πρωτόκολλο για την αποσιώπηση του GR και την αντίσταση των Τ-κυττάρων στα στεροειδή με γονιδιακή αλλά και επιγενετική επεξεργασία. Με αυτήν την προσέγγιση γίνεται μία προσπάθεια διεύρυνσης της εφαρμογής της ΥΑ και σημαντικής βελτίωσης της έκβασης των μεταμοσχεύσεων, ιδιαίτερα στους ασθενείς που είναι πιο ευάλωτοι σε λοιμώξεις, όπως αυτοί που λαμβάνουν υψηλές δόσεις στεροειδών μετά την allo-HSCT.