Μελέτη της επαγωγής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα με αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών

Abstract

The apoptotic process is accompanied by chromatin conformational changes. Among the numerous factors that take part in these chromatin rearrangement events, of importance, are epigenetic modifications, such as acetylation/deacetylation of nucleosomal histones, and certain histone subtypes, of which the H1 DNA linker histone subtypes play a major role. Histone deacetylase inhibitors cause the accumulation of acetylated nucleosomal histones, resulting in the “relaxation” of the chromatin structure and transcription of certain genes, one of which is the H1 linker histone replacement subtype, H1.0. Depending on the cell type, the transcriptional changes which are brought about by these agents, may lead to cell cycle inhibition, induction of terminal differentiation or induction of apoptosis. Moreover, hyperacetylated nucleosomes may be more accessible to DNA endonucleases which are responsible for the DNA fragmentation that takes place during the last stages of apoptosis. Of importance in this thesis work, is that in vitro experiments of other groups have shown that one of the major and most significant apoptotic endonucleases, DFF40, is activated by DNA linker proteins. In light of the above, the first part of this thesis work involved the investigation of the differential effects of trichostatin A and sodium butyrate, two histone deacetylase inhibitors in six leukemic cell lines of different pathological origin. This part of the study focused on the effect of these two inhibitors as to the degree of histone H4 acetylation, the induction of, or increase in expression levels of the DNA linker histone, H1.0, as compared to the degree of apoptosis induction. The results showed that the six leukemic cell lines responded differently (showed differential sensitivity) to the inhibitors and with the exception of the K562 cell line which was completely resistant, the degree of apoptosis induction was different and specific for each of the responsive cell lines. In order to answer the question as to whether histone H4 acetylation and/or the induction or upregulation of H1.0 expression can be used as proapoptotic markers, 24-hour time kinetics experiments were carried out in 3 (most responsive, MOLT-4, NB4, HL60) of the 6 cell lines in order to access the chronological order of each parameter (i.e., histone acetylation, H1.0 induction, apoptosis). The results demonstrated that histone H4 acetylation is an early event followed, after a short time-lag, by the induction or up- regulation of H1.0 expression and, lastly, by the induction of apoptosis. Important is the finding that the resistant (to apoptosis) K562 cell line did not have increased acetylation levels or H1.0 induction. It is worth mentioning at this point, that under certain conditions, the apoptotic process may take place without DNA fragmentation or DNA fragmentation may be executed by another endonuclease. Therefore, the choice of the of the cell line for the second part of this thesis work was also based on the involvement of the endonuclease, DFF40, in the apoptotic events induced by these inhibitors. Based on all the results briefly mentioned above, the NB4 cell line and trichostatin A were chosen for the continuation of this thesis work. The second part of this study specifically focused on the investigation of the interaction (and the degree of this interaction) of DFF40 with specific H1 subtypes in order to ascertain, under these specific apoptotic conditions and with the selected cell line, whether a certain subtype played a more preferential role in the activation and the apoptotic activity of DFF40. The subtypes that were analyzed were H1.0 as well as three of the five somatic subtypes, H1.5, H1.3 and H1.1. The relevance of analyzing these four different subtypes is that previous work of other groups have shown that the H1 subtypes may have specific functional roles in chromatin structural reorganization events. The results of this line of work showed that, both under physiological, as well as under apoptotic conditions, DFF (the non-active heterodimer, DFF40-DFF45) is located in the nucleus and, specifically, on chromatin. These results are of significance since previous work of other investigators suggested that DFF40-DFF45 resides in the cytoplasm under non-apoptotic conditions and is translocated to the nucleus after the induction of apoptosis. In continuation, co-immunoprecipitation experiments showed that DFF40 interacts with total histone H1 and also with all the subtypes (H1.1, H1.3, H.15, H1.0) studied in this investigation under both apoptotic as well as non-apoptotic conditions. However, under apoptotic conditions, DFF40 preferentially interacted (interacted to a significantly greater extent) with H1.5 and H1.0, in contrast to H1.3, with which a significant decrease in the interaction with DFF40 and this subtype was observed. These results are of significance since the in vitro experiments of another group, using naked DNA and truncated constructs, had shown that all somatic H1 subtypes (H1.1, H1.2, H1.3, H1.4, H1.5) as well as the replacement subtype, H1.0, interacted to the same extent with DFF40. The results of this thesis work show that DFF40 interacts in a preferential manner with specific H1 subtypes in vivo. This may be cell-type specific and/or specific to the apoptotic agent. Moreover, other, as yet, unknown chromatin factors may be involved which were absent from the in vitro experiments. Another enticing explanation, for the in vivo preferences shown by DFF40 in this work may possibly be related to the specific functional roles played by each subtype in chromatin reorganization events. In conclusion, in this work, it was found that trichostatin A is an effective histone deacetylase inhibitor with the ability to hyperacetylate histones and induce apoptosis in the leukemic cell lines of this study in a time- and cell-type-dependent manner. The following briefly summarize the main conclusions and/or implications from the findings of this thesis work: (1) the increase in histone acetylation levels by histone deacetylase inhibitors may possibly be used as an additional index for accessing the apoptotic responsiveness or sensitivity of cancer cell types to other histone deacetylase inhibitors as to their effectiveness in inducing apoptosis, (2) the heterodimer, DFF40-45 resides in the nucleus and moreover, in the chromatin fraction, even under nonapoptotic conditions where the non-hydrolyzed (by caspase-3) DFF45 maintains DFF40 in a non-activated state and, (3) DFF40 interacts with each H1 subtype analyzed in this study in a preferential manner under the apoptotic conditions induced by TSA in the NB4 leukemic cell line.

Η απόπτωση συνοδεύεται από µεγάλες αναδιατάξεις στη στερεοδιαµόρφωση της χρωµατίνης. Στις αναδιατάξεις αυτές σηµαντικό ρόλο παίζουν επιγενετικές τροποποιήσεις όπως είναι η ακετυλίωση/αποακετυλίωση των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος, καθώς και ορισµένες ποικιλοµορφίες ιστονών, µε πρωτεύοντα ρόλο τις ιστόνες του συνδέτου DNA, H1. Αναστολείς των αποακετυλασών προκαλούν την συσσώρευση ακετυλιώσεων στις ουρές των ιστονών του πυρήνα του νουκλεοσώµατος, µε αποτέλεσµα να χαλαρώνει η δοµή της χρωµατίνης και να επάγεται η µεταγραφή ορισµένων γονιδίων, ένα εκ των οποίων είναι και το γονίδιο της ιστόνης αντικατάστασης, Η1.0, η οποία ανήκει στην οικογένεια των Η1 ιστονών του συνδέτου DNA. Η αλλαγή της µεταγραφικής ενεργότητας που επιφέρουν αυτές οι ουσίες έχει σαν τελικό αποτέλεσµα, ανάλογα µε το κυτταρικό σύστηµα, την αναστολή του κυτταρικού κύκλου, την επαγωγή της τερµατικής διαφοροποίησης, ή την επαγωγή της απόπτωσης. Επίσης, η χαλάρωση της χρωµατίνης, που επιφέρουν τα αυξηµένα επίπεδα ακετυλίωσης, δίνει την δυνατότητα πρόσβασης ενδονουκλεασών στο DNA, οι οποίες κατακερµατίζουν το DNA κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Πολύ σηµαντικό για την παρούσα µελέτη είναι το γεγονός πως ή ενδονουκλεάση, DFF40, η οποία παίζει µείζονα ρόλο κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης σε µεγάλο αριθµό κυτταρικών συστηµάτων και αποπτωτικών συνθηκών, έχει δειχτεί µε in vitro πειράµατα άλλων οµάδων πως ενεργοποιείται από πρωτείνες του συνδέτου DNA. Στο πρώτο µέρος της διατριβής µελετήθηκε η διαφορική επίδραση της τριχοστατίνης Α και του βουτυρικού νατρίου, δύο αναστολέων των αποακετυλασών των ιστονών, στην επαγωγή απόπτωσης σε έξι λευχαιµικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής παθολογικής προέλευσης. Μελετήθηκε η επίδραση των δύο αναστολέων στο βαθµό ακετυλίωσης της ιστόνης Η4, στην επαγωγή ή αύξηση της έκφρασης της ιστόνης του συνδέτου Η1.0, σε σύγκριση µε τα επίπεδα επαγωγής απόπτωσης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι οι έξι λευχαιµικές κυτταρικές σειρές εµφανίζουν διαφορετική ευαισθησία έναντι των δύο αναστολέων και εκτός από την ερυθρολευχαιµκή σειρά Κ562, η οποία αποδεικνύεται ανθεκτική στους δύο αναστολείς, η επαγόµενη απόπτωση στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές έχει τιµές που χαρακτηρίζουν την κάθε σειρά. Προκειµένου να απαντηθεί το ερώτηµα αν τόσο η ακετυλίωση της Η4 όσο και η αύξηση της έκφρασης της Η1.0 µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως προαποπτωτικοί δείκτες, πραγµατοποιήθηκε µια σειρά πειραµάτων κινητικής χρόνου σε τρεις επιλεγµένες µεταξύ των έξι λευχαιµικών σειρών (ΜΟLT-4, NB4 και HL60) στις οποίες εξετάστηκε ποια από τις τρεις παραµέτρους (ακετυλίωση της Η4, αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και επαγωγή απόπτωσης) προηγείται χρονικά, ποια έπεται και ποια ακολουθεί. Η ακετυλίωση της Η4 προηγείται χρονικά, ακολουθεί µε µικρή χρονική καθυστέρηση η αύξηση των επιπέδων της Η1.0 και έπεται η επαγωγή του φαινοµένου της απόπτωσης. Σηµαντικό είναι το εύρηµα πως στα ανθεκτικά (ως προς την επαγωγή απόπτωσης) Κ562 κύτταρα, επίσης δεν παρατηρήσαµε αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης ή την επαγωγή της Η1.0. Αξίζει να αναφέρουµε πως κάτω από ορισµένες συνθήκες, η αποπτωτική διαδικασία ενδέχεται να ολοκληρωθεί και χωρίς αποδόµηση του DNA ή να εκτελεστεί η αποδόµηση µε άλλη ενδονουκλεάση. Εποµένως, η επιλογή της (των) καταλληλότερης σειράς βασίστηκε στην εµπλοκή της συγκεκριµένης ενδονουκλεάσης στην αποπτωτική πορεία κατά τα τελευταία στάδια της απόπτωσης. Με βάση όλα αυτά τα αποτελέσµατα επιλέχτηκε η ΝΒ4 κυτταρική σειρά και η τριχοστατίνη Α για την συνέχιση της εργασίας. Το δεύτερο µέρος της διατριβής εστιάστηκε σε πειράµατα όπου µελετήθηκε η αλληλεπίδραση, καθώς και ο βαθµός αυτής της αλληλεπίδρασης, του DFF40 µε συγκριµένους υποτύπους της τάξης των Η1 ιστονών για να διερευνηθεί αν κάτω από τις συγκεκριµένες αποπτωτικές συνθήκες και στην συγκεκριµένη επιλεγµένη λευχαιµική σειρά, κάποιος Η1 υπότυπος παίζει έναν πιο εξειδικευµένο ρόλο στην ενεργοποίηση και στην αποπτωτική δράση του DFF40. Οι υπότυποι που µελετήθηκαν ήταν πρωτίστως η Η1.0, αλλά και οι υπότυποι Η1.5, Η1.3 και Η1.1, εφόσον, από βιβλιογραφικά δεδοµένα, οι διάφοροι υπότυποι της οικογένειας Η1 έχουν συνδεθεί µε λειτουργικές διαδικασίες κατά την αναδιάταξη της χρωµατίνης. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε αποπτωτικές συνθήκες ο DFF (είναι το ανενεργό ετεροδιµερές αποτελούµενο από τον DFF40-DFF45) εντοπίζεται στο εσωτερικό του πυρήνα, και συγκεκριµένα στην χρωµατίνη. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι σηµαντικά διότι παλαιότερα πειραµατικά δεδοµένα από άλλες ερευνητικές οµάδες είχαν δείξει ότι ο DFF40-DFF45 βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα κάτω από µη αποπτωτικές συνθήκες και εισέρχεται στο πυρήνα µετά από αποπτωτικό ερέθισµα. Στην συνέχεια, µε in vivo πειράµατα συνανοσοκατακρήµνισης διαπιστώθηκε η αλληλεπίδραση του DFF40 µε την ιστόνη Η1 (ολικό κλάσµα) και µε όλους τους υποτύπους (Η1.1, Η1.3, Η1.5 και Η1.0) που µελετήθηκαν, τόσο σε φυσιολογικές, όσο και σε αποπτωτικές συνθήκες. Όµως κάτω από αποπτωτικές συνθήκες παρατηρήθηκε µία εκλεκτική (σηµαντικά αυξηµένη) αλληλεπίδραση του DFF40 µε τις Η1.5 και Η1.0 σε αντίθεση µε την Η1.3, η οποία είχε σαφέστατα χαµηλότερη αλληλεπίδραση. Το αποτέλεσµα αυτό είναι ουσιώδες εφόσον in vitro πειράµατα άλλης οµάδας, µε γυµνό DNA και µε µεταλλαγµένα κατασκευάσµατα, είχαν δείξει πως όλοι οι σωµατικοί υπότυποι (Η1.1, Η1.2, Η1.3, Η1.4, Η1.5), καθώς και ο υπότυπος αντικατάστασης, Η1.0, αλληλεπιδρούν εξίσου µε τον DFF40. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης έδειξαν πως ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά in vivo, εύρηµα που ενδέχεται να σχετίζεται όχι µόνο µε την συγκεκριµένη λευχαιµική σειρά αλλά και µε το συγκεκριµένο αποπτωτικό µέσο, καθώς και µε άλλους, ακόµη άγνωστους, παράγοντες της χρωµατίνης που φυσικά απουσίαζαν από τα πειράµατα της συγκεκριµένης ερευνητικής οµάδας µε γυµνό DNA. Επίσης, το ποσοστό αλληλεπίδρασης κάθε υποτύπου µε την ενεργή νουκλεάση µπορεί να σχετίζεται µε τον λειτουργικό ρόλο αυτού στη στερεοδιαµόρφωση της χρωµατίνης. Συµπερασµατικά, διαπιστώθηκε ότι η τριχοστατίνη Α αποτελεί έναν πολύ σηµαντικό αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών που είναι ικανός να επάγει το φαινόµενο της απόπτωσης σε µια σειρά από επιλεγµένες λευχαιµικές σειρές ανθρώπου (κατά ένα χρονο-εξαρτώµενο και κυτταρο-εξαρτώµενο τρόπο) µέσω της υπερακετυλίωσης των ιστονών. Συνοπτικά, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης οδηγούν στα ακόλουθα συµπεράσµατα: (α) η αύξηση των επιπέδων ακετυλίωσης από αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών ενδεχοµένως να αποτελέσει έναν επιπλέον χρήσιµο δείκτη για την αξιολόγηση της ικανότητας συγκεκριµένων αναστολέων να επάγουν απόπτωση σε συγκεκριµένες λευχαιµικές σειρές, (β) το ετεροδιµερές DFF40-DFF45 εντοπίζεται στον πυρήνα και µάλιστα στην χρωµατίνη, ακόµη και σε µη αποπτωτικές συνθήκες όπου ο µη πρωτεολυµένος (από την κασπάση 3) DFF45 διατηρεί τον DFF40 σε µη ενεργή µορφή και, (γ) ο DFF40 αλληλεπιδρά διαφορικά µε κάθε Η1 υπότυπο που αναλύθηκε στη παρούσα µελέτη κάτω από τις αποπτωτικές συνθήκες που επάγονται από το TSA στα ΝΒ4 προµυελοκυτταρικά λευχαιµικά κύτταρα.