CD8 Τ κυτταρική απάντηση έναντι των αντιγόνων MAGE στον καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

OBJECTIVE The aim of cancer immunotherapy is to stimulate pre-existing anti-tumour specific CD8+ T cells, in order to recognise and destroy the cancer. Although such destruction has been described for a limited number of patients, the study of the interplayers of such an effect has never taken place in conjunction with normal individuals. This study was scheduled in order to determine in patients with lung cancer the magnitude and function of the pre-existing, naturally occurring cytolytic CD8+ T-cell responses against peptides of the most widely used cancer-testis antigens in cancer immunotherapy, namely MAGE-A1 and MAGE-A3 and compare these findings with those that might be unravelled in aged-matched healthy individuals.MATERIALS Peripheral blood mononuclear cells were collected from 15 patients with non-small cell lung carcinoma and 10 patients with small cell lung carcinoma upon diagnosis and 15 aged matched healthy individuals, expressing at least one of the HLA-A1, -A2, -A24 and/or HLA-B35 alleles. In 16 of the patients, cells were also collected 3-6 months post treatment with chemotherapy and/or radiotherapy. Finally, in 11 patients that underwent surgery for removal of their tumour, tumor infiltrating lymphocytes and tumor tissue were collected. METHODS The frequency of peptide-specific T cells was estimated using a sensitive method that combines HLA-multimer flow cytometric technology with a previous step of in vitro amplification under limiting dilution conditions. Amplified T cells were magnetically sorted and used to: (a) characterise their ability to lyse chromium labelled cells expressing the relevant antigens, (b) determine their TCR affinity against peptide loaded chromium labelled cells, (c) identify the expression of the differentiation molecules CD28, CD45RA, CD45RO and CCR7 by flow cytometry, (d) determine their ability to secrete IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ and TNF-α after peptide specific stimulation, (e) determine the expression of Bcl-2 transcripts, and finally (f) determine the TcR Vβ sequence.RESULTS Anti-MAGE CD8 Τ cells were detected in the blood of both healthy individuals and lung cancer patients upon diagnosis. The cumulative frequency of circulating peptide-specific T cells was found to be higher in cancer patients (13±20.5 x 10-7) than normal individuals (1.8±1 x 10-7), varied widely amongst patients and was not affected by radiotherapy and/or chemotherapy. Amongst patients, the most frequent responses were those detected against MAGE-A3.Α2 and MAGE-A3.Α24 (36% και 44%, respectively), whereas 56% of normal individuals responded against the MAGE-A3.Α2 peptide. T cell responses against the other peptides were limited in both groups. Patients had similar numbers of anti-EBV T cells as did normal individuals. In none of the tumor infiltrating lymphocyte samples was an anti-MAGE T cell response detected despite the identification of anti-EBV T cells. Compared to normal individuals, CD8 T cells from patients presented with a reduced ability to lyse targets (p=0.013), proliferate to antigenic stimuli (p=0.041) and to bind the peptide-MHC complex with a high affinity (p=0.038). All anti-tumour specific T cells, irrespective of their origin, displayed a memory phenotype (CD28+/CD57-), expressed Bcl-2 and secreted ΙL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ and TNF-α but not IL-10. CONCLUSION This study uncovered that cancer patients present with a wide variation in the frequency of peptide-specific pCTLs and this frequency differs greatly between tumor-antigen peptides. Furthermore, tumor-specific pCTLs of cancer patients present with functional differences when compared to those of healthy individuals. In the light of recent evidence, both of these findings (number and function) might have played a detrimental role in the limited success of current immunotherapy protocols and could represent an important determinant for the fate of cancer immunotherapy. Thus, improving our understanding as to what affects these parameters, promises to have a significant impact on the design of future cancer immunotherapy protocols.

ΣΚΟΠΟΣ Στόχος της ανοσοθεραπείας του καρκίνου είναι η ενεργοποίηση της προϋπάρχουσας κυτταρολυτικής CD8+ Τ απάντησης έναντι αντιγόνων των όγκων με σκοπό την αναγνώριση και καταστροφή καρκινικών κυττάρων. Ενώ αυτό έχει επιτευχθεί σε ασθενείς με συγκεκριμένους τύπους καρκίνου, εντούτοις η μελέτη του φαινομένου σε πληθυσμιακό επίπεδο, καθώς και η μελέτη των χαρακτηριστικών αυτής της απάντησης με την αντίστοιχη φυσιολογικών ατόμων ιδίας ηλικίας, δεν έχει γίνει μέχρι τώρα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, κατά τη διάγνωση, το μέγεθος και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά της προϋπάρχουσας κυτταρολυτικής CD8+ Τ απάντησης έναντι πεπτιδίων των δύο κυριοτέρων αντιγόνων των όγκων, MAGE-A1 και MAGE-A3, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως στην ανοσοθεραπεία και να συγκριθούν με τα αντίστοιχα CD8+ Τ κύτταρα που ενδεχομένως ανιχνεύονται σε υγιή άτομα.ΥΛΙΚΟ Συλλέχθηκε περιφερικό αίμα από 15 ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και 10 με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κατά τη διάγνωση της νόσου καθώς και από 15 υγιείς μάρτυρες, οι οποίοι έφεραν τουλάχιστον ένα από τα αλλήλια HLA-A1, -A2, -A24 και/ή HLA-B35. Σε 16 από τους παραπάνω ασθενείς, περιφερικό αίμα συλλέχθηκε επίσης 3-6 μήνες μετά τη χορήγηση χημειοθεραπείας ή/και ακτινοθεραπείας. Επιπρόσθετα, από 11 από τους παραπάνω ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση του όγκου, παρασκευάστηκε εναιώρημα κυττάρων του όγκου. ΜΕΘΟΔΟΙ Η συχνότητα των ειδικών έναντι πεπτιδίων των αντιγόνων MAGE-A1 και MAGE-A3 κυτταρολυτικών CD8+ Τ κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μία ευαίσθητη τεχνική που συνδυάζει αντιγονοειδική in vitro ενεργοποίηση υπό συνθήκες φθίνουσας συγκέντρωσης και ανίχνευση με κυτταρομετρία ροής, μέσω της τεχνολογίας των HLA-πολυμερών. Τα αντιγονοειδικά κύτταρα απομονώθηκαν με μαγνητικό διαχωρισμό και μελετήθηκε: (α) η ικανότητά τους να λύουν καρκινικά κύτταρα σεσημασμένα με 51Cr, (β) η συγγένεια του TcR τους ως προς το ειδικό πεπτίδιο με τη χρήση 51Cr σεσημασμένων κυττάρων, (γ) η έκφραση των επιφανειακών μορίων διαφοροποίησης CD28, CD45RA, CD45RO και CCR7 με κυτταρομετρία ροής, (δ) η ικανότητά τους να εκκρίνουν IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ και TNF-α έπειτα από ειδική και μη ειδική πεπτιδική διέγερση, (ε) η έκφραση μεταγράφων του Bcl-2, και τέλος (ζ) η αλληλουχοποίηση της Vβ περιοχής του TCR.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο περιφερικό αίμα των ασθενών, κατά τη διάγνωση, ανιχνεύθηκε αυξημένη συχνότητα αντιγονοειδικών CD8+ Τ κυττάρων που αναγνωρίζουν πεπτίδια των πρωτεϊνών MAGE-A1 και MAGE-A3 (13±20,5 x 10-7) συγκριτικά με τη συχνότητα παρόμοιων κυττάρων στο αίμα υγιών ατόμων (1,8±1 x 10-7). Η συχνότητα αυτή, παρουσίαζε μεγαλύτερη διακύμανση στους ασθενείς και δεν επηρεάστηκε από το είδος της θεραπείας. Ανάμεσα στους ασθενείς, η συχνότερη απάντηση ήταν έναντι των πεπτιδίων MAGE-A3.Α2 και MAGE-A3.Α24 (36% και 44%, αντίστοιχα), ενώ ανάμεσα στους υγιείς, το 56% εμφάνισε απάντηση έναντι του πεπτιδίου MAGE-A3.Α2. Αντίθετα, η απάντηση έναντι των MAGE-A3.A1, MAGE-A3.B35 και MAGE-A1 πεπτιδίων ήταν πρακτικά μη ανιχνεύσιμη. Οι ασθενείς με καρκίνο είχαν αντι-EBV CD8+ Τ κύτταρα στα ίδια επίπεδα με αυτά των φυσιολογικών ατόμων. Στα TILs των ασθενών, δεν ανιχνεύθηκε CD8+ Τ απάντηση έναντι πεπτιδίων των MAGE-A3 και MAGE-A1 παρά μόνο έναντι ιικών πεπτιδίων. Σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα, τα αντιγονοειδικά CD8+ Τ κύτταρα των ασθενών, παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική μείωση της ικανότητάς τους να λύουν κύτταρα-στόχους (p=0,013), μειωμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού (p=0,041) και μικρότερη ικανότητα σύνδεσης με τα HLA-πολυμερή (p=0,038). Όλα τα αντιγονοειδικά CD8+ Τ κύτταρα, ανεξαρτήτως προέλευσης, είχαν φαινότυπο μνημονικών κυττάρων (εκφράζοντας CD28, αλλά όχι CD57), εξέφραζαν Bcl-2 και εμφάνιζαν παρόμοια ικανότητα παραγωγής ΙL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ και TNF-α, αλλά όχι IL-10. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Παρατηρήθηκε ότι, οι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, παρουσιάζουν στο περιφερικό τους αίμα ευρύτατη διακύμανση στη συγκέντρωση αντιγονοειδικών CD8+ Τ κυττάρων με σημαντικές λειτουργικές διαφορές από τα αντίστοιχα των φυσιολογικών ατόμων. Τα χαρακτηριστικά αυτά (αριθμός και λειτουργία), θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν καθοριστικούς παράγοντες για την επιτυχή έκβαση της ανοσοθεραπείας του καρκίνου και να εξηγήσουν τη μέχρι τώρα χαμηλή ανταπόκριση των ασθενών σε πρωτόκολλα εμβολιασμών.