Περίληψη
Μελετήσαμε την ικανότητα έκφρασης RNA και ρετρομετάθεσης του ρετροϊού HERV-K10 σε κύτταρα HeLa, A549 και H1299 και σε ανθρώπινα ωοκύτταρα. Ανιχνεύσαμε έκφραση RNA του σε υψηλά επίπεδα και κατασκευάσαμε ανασυνδυασμένους ελλειμματικούς ρετροϊούς σημασμένους με ειδική κασέτα ανίχνευσης της ρετρομετάθεσης που βασίζεται στην έκφραση της φθορισμογόνου πρωτεΐνης EGFP. Μετά από διαμόλυνση καρκινικών κυτταρικών σειρών με αυτούς και μικροένεσή τους σε άωρα ανθρώπινα ωοκύτταρα, μέσω μικροσκοπίας UV ανιχνεύσαμε γεγονότα ρετρομετάθεσης, τα οποία πιστοποιήθηκαν σε επίπεδο γονιδιώματος με PCR, ενώ επιπλέον με FACS μετρήθηκε η συχνότητα ρετρομεταθέσεων σε υψηλά επίπεδα ως και 38.3%. Υψηλή συχνότητα ρετρομετάθεσης συσχετίζεται με έντονες φαινοτυπικές αλλαγές, διαταραχές του κυτταρικού κύκλου με συσσώρευση κυττάρων στη G2/M και πολλαπλές θραύσεις στα χρωμοσώματα. Αποδείξαμε ότι τα γεγονότα ρετρομετάθεσης συμβαίνουν χάρη στην εξειδικευμένη δράση αντίστροφης μεταγραφάσης ειδικής για τα HERV-K10 που κωδικο ...
Μελετήσαμε την ικανότητα έκφρασης RNA και ρετρομετάθεσης του ρετροϊού HERV-K10 σε κύτταρα HeLa, A549 και H1299 και σε ανθρώπινα ωοκύτταρα. Ανιχνεύσαμε έκφραση RNA του σε υψηλά επίπεδα και κατασκευάσαμε ανασυνδυασμένους ελλειμματικούς ρετροϊούς σημασμένους με ειδική κασέτα ανίχνευσης της ρετρομετάθεσης που βασίζεται στην έκφραση της φθορισμογόνου πρωτεΐνης EGFP. Μετά από διαμόλυνση καρκινικών κυτταρικών σειρών με αυτούς και μικροένεσή τους σε άωρα ανθρώπινα ωοκύτταρα, μέσω μικροσκοπίας UV ανιχνεύσαμε γεγονότα ρετρομετάθεσης, τα οποία πιστοποιήθηκαν σε επίπεδο γονιδιώματος με PCR, ενώ επιπλέον με FACS μετρήθηκε η συχνότητα ρετρομεταθέσεων σε υψηλά επίπεδα ως και 38.3%. Υψηλή συχνότητα ρετρομετάθεσης συσχετίζεται με έντονες φαινοτυπικές αλλαγές, διαταραχές του κυτταρικού κύκλου με συσσώρευση κυττάρων στη G2/M και πολλαπλές θραύσεις στα χρωμοσώματα. Αποδείξαμε ότι τα γεγονότα ρετρομετάθεσης συμβαίνουν χάρη στην εξειδικευμένη δράση αντίστροφης μεταγραφάσης ειδικής για τα HERV-K10 που κωδικοποιείται από ενδογενή στοιχεία Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι ο ενδογενής ρετροϊός HERV-K10 είναι ρετρομεταθετικά ενεργός, ακόμα και ελλειμματικός, και ότι τα καρκινικά και αναπτυσσόμενα γαμετικά κύτταρα αποτελούν ευνοϊκό περιβάλλον για τη γένεση γεγονότων ρετρομετάθεσης.
Έπειτα, μελετήσαμε το πρότυπο μεθυλίωσης DNA του ρετροτρανσποζονίου HERV-K10 και των γονιδίων με αποτύπωση DLK1/MEG3, CDKN1C (p57KIP2) και IGF2/H19 σε χοριακές λάχνες από παιδιά που γεννήθηκαν μετά από IVF-PGD και βιοψίες όρχεων και σπέρμα υπογόνιμων ανδρών με MS-PCR. Στην ομάδα PGD, διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της μεθυλίωσης του HERV-K10 και του DLK1/MEG3 σε σύγκριση με το μάρτυρα. Σε βιοψίες όρχεων βρέθηκε εκτεταμένη διαταραχή των προτύπων μεθυλίωσης γονιδίων με αποτύπωση. Στο σπέρμα διαπιστώθηκε ήπια διαταραχή της μεθυλίωσης των HERV-K10, ενώ η διαταραχή των γονιδίων με αποτύπωση που μελετήθηκαν ήταν κατά σειρά μειούμενης σφοδρότητας DLK1/MEG3>IGF2/H19>CDKN1C (p57KIP2). Η ανάλυση της αλληλουχίας των υπό μελέτη γονιδίων με εργαλεία βιοπληροφορικής κατέδειξε ότι το DLK1/MEG3 φέρει υψηλότατη περιεκτικότητα σε μεταθετά στοιχεία, το IGF2/H19 χαμηλή και το CDKN1C (p57KIP2) ακόμη χαμηλότερη. Σημαντική διαταραχή των προτύπων μεθυλίωσης γονιδίων με πατρικό αποτύπωμα φαίνεται να συσχετίζεται με σοβαρής μορφής υπογονιμότητα, ενώ η ταυτόχρονη διαταραχή των προτύπων μεθυλίωσης των γονιδίων DLK1/MEG3 και IGF2/H19 θα μπορούσαν πιθανώς να αποτελέσουν δείκτη της ποιότητας του σπέρματος. Φαίνεται ότι η μεταβολή των προτύπων μεθυλίωσης του HERV-K10 συσχετίζεται με εκείνη γονιδίων με αποτύπωση που βρίσκονται σε περιοχές πλούσιες σε μεταθετά στοιχεία.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
We have studied the RNA expression levels and retrotrasposition potential of HERV-K10 in cancer cell lines (HeLa, A549 and H1299) and immature human oocytes. We have detected high levels of expressed HERV-K10 RNA and constructed truncated recombinant retroviruses tagged with an EGFP gene-based retrotransposition cassette for the detection of retrotransposition events. Cancer cell lines were transfected and immature human oocytes were microinjected with the recombinant construct. We detected retrotransposition events through EGFP-positive cells, further confirmed in the genome by PCR analysis. Using FACS, measured retrotransposition frequency was found at high levels up to 38.3%. High retrotransposition levels are related to phenotypic changes of the cells, cell cycle disturbance with cease of cells in G2/M phase and multiple chromosomal breaks. We have also shown that retrotransposition events take place due to the expression of a HERV-K10-specific RT encoded by endogenous elements. Ou ...
We have studied the RNA expression levels and retrotrasposition potential of HERV-K10 in cancer cell lines (HeLa, A549 and H1299) and immature human oocytes. We have detected high levels of expressed HERV-K10 RNA and constructed truncated recombinant retroviruses tagged with an EGFP gene-based retrotransposition cassette for the detection of retrotransposition events. Cancer cell lines were transfected and immature human oocytes were microinjected with the recombinant construct. We detected retrotransposition events through EGFP-positive cells, further confirmed in the genome by PCR analysis. Using FACS, measured retrotransposition frequency was found at high levels up to 38.3%. High retrotransposition levels are related to phenotypic changes of the cells, cell cycle disturbance with cease of cells in G2/M phase and multiple chromosomal breaks. We have also shown that retrotransposition events take place due to the expression of a HERV-K10-specific RT encoded by endogenous elements. Our findings demonstrate for the first time that endogenous retrovirus HERV-K10 is retrotransposition-competent, even if truncated/mutated, and that cancer and developing germ cells provide a cellular environment favorable for generation of retrotransposition events.
Next, we have studied DNA methylation patterns of HERV-K10 retrotransposon and DLK1/MEG3, CDKN1C (p57KIP2) and IGF2/H19 imprinted genes using MS-PCR in CVs from children conceived after IVF-PGD and testis biopsies and sperm samples from infertile men. In the PGD group, MS-PCR analysis revealed a statistically significant alteration of HERV-K10 and DLK1/MEG3 methylation pattern compared to controls. Aberrant methylation patterns were found in the paternally imprinted genes tested in biopsy samples. In sperm samples, there has been observed a mild aberration of HERV-K10, while the severity of the aberration of the imprinted genes tested was as follows: DLK1/MEG3>IGF2/H19>CDKN1C (p57KIP2). Sequence analysis of the imprinted genes studied using bioinformatics uncovered high content in transposable element derived sequences was high in the case of DLK1/MEG3, quite low for IGF2/H19 and even lower for CDKN1C (p57KIP2). Consequently, profound aberration of the methylation patterns of paternally imprinted genes are possibly associated with severe infertility and simultaneous aberration of DLK1/MEG3 and IGF2/H19 could be used as sperm quality marker. Our results suggest that altered HERV-K10 methylation is correlated to imprinting alterations in a retrotransposon-rich genomic region, and that retrotransposons may play a role in the regulation of imprinting.
περισσότερα