Επίδραση διεργασιών οινοποίησης στα φαινολικά συστατικά του οίνου

Abstract

Changes in the principal phenolic compounds during the vinification process and storage under modified atmosphere of Greek wines have been investigated. HPLC-DAD-ESI-MS/MS was used for the identification and quantification of more than 30 principal phenolic compounds, namely anthocyanins (malvidin, etc.), flavonols (quercetin, myricetin, etc.,), flavan-3-ols (catechin) and hydroxycinnamates (caftaric and coutaric acid). The existence of some of these molecules (laricitrin, syringetin and isoramnetin), was confirmed for the first time in Greek wines.During maceration, the most polar molecules, like anthocyanins, were extracted imminently, while the flavan-3-ols followed at a lower rate after a lag phase. In all varieties, the total phenol content reached a maximum within 2-8 days. The effect of vinification processes, like cold maceration and addition of pectolytic enzymes, has been studied. Both processes enhanced the extraction of grape polyphenols during the vinification. Moreover, during cold maceration, due to the low ethanol content and the obstruction of the fermentation, the more polar and water soluble constituents presented increased extraction rates, whereas the extraction of flavan-3-ols was suspended. On the other hand, the use of pectolytic enzymes did not appear to affect the extraction rates of phenolic compounds. Comparing the variation of metals at maceration process, with the variation of monomeric anthocyanins and flavonols, an inverse relationship was noticed that can be attributed to complexing reactions of polyphenols with particular trace elements. During one year storage, the concentration of total phenols remained practically constant and even samples stored under a thin atmospheric air layer, retained up to 80% of their initial phenolic content. On the contrary, free anthocyanins, participated in polymerization reactions with flavan-3-ols and their concentration declined almost tenfold during a few months, following 1st order kinetics. Also, enzymatic hydrolysis of other phenolic compounds like flavonol glycosides and tartaric esters that lead to the respective aglycones and hydroxycinnamic acids was observed. The modified atmosphere had little effect on the observed changes of phenolic constituents, except for the decrease of monomeric anthocyanins. The rate constants of the reactions presented a significant difference (p<0.05) between the MAP stored samples and the blind samples that were packaged with atmospheric air. Considering the evolution of color during storage, the indexes of color intensity (CI) and brilliance (dA%) declined, while the hue index (T) followed an increasing trend during storage of red wines. The statistical evaluation of the results did not detect significant differences on color parameters due to storage under different modified atmosphere. Copigmentation of anthocyanins accounts for over 30% of the fresh red wine color, while during storage, the color of polymeric pigments formed between anthocyanins and proanthocyanidins predominates. Rosmarinic acid and natural extracts rich in hydroxycinnamic acids, obtained from aromatic plants (Origanum vulgare and Satureja thymbra), were examined as cofactors to fresh Merlot wine and the effect on anthocyanin copigmentation and wine color was studied during storage for 6 months. An increase of the copigmented anthocyanins that enhanced color intensity by 15–50% was observed, confirming the ability of complex hydroxycinnamates to form copigments. The samples with added cofactors retained higher percentages of copigmented anthocyanins and higher color intensity, compared to the control wine, up to 3 months. However, the change in the equilibrium between monomeric and copigmented anthocyanins that was induced by added cofactors, did not affect the rate of polymerization reactions during storage.

Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη των μεταβολών φαινολικών συστατικών κατά την βιομηχανική οινοποίηση και την αποθήκευση υπό συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας ελληνικών κρασιών. Για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση των κύριων φαινολικών συστατικών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης συζευγμένης με συστοιχία φωτοδιόδων και φασματογράφο μάζας (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Η μελέτη του φαινολικού προφίλ επέτρεψε την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση περισσοτέρων από 30 φαινολικών μορίων. Τα φαινολικά αυτά μόρια ανήκουν στις ομάδες των φαινολικών οξέων (κουταρικό & καφταρικό οξύ), φλαβονολών (κερκετίνη, μυρισετίνη, κ.ά.), φλαβαν-3-ολών (κατεχίνη) και ανθοκυανών (μαλβιδίνη, κ.ά.), ενώ κάποια από αυτά τα μόρια (λαρικιτρίνη, συρινγκετίνη, ισοραμνετίνη) ανιχνεύτηκαν για πρώτη φορά σε ελληνικά κρασιά. Βασικός στόχος ήταν η εξέταση της μεταφοράς των φαινολικών συστατικών από το σταφύλι στο ζυμούμενο γλεύκος, και η εξέλιξή τους κατά τις διαφορετικές, συνήθεις πρακτικές που ακολουθούνται στην οινοποίηση. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκαν Ελληνικές κυρίως ποικιλίες που δεν έχουν ή έχουν ελάχιστα μελετηθεί, καθώς και διεθνείς ποικιλίες που καλλιεργούνται ευρύτατα και στην Ελλάδα. Επίσης όλα τα πειράματα έγιναν σε συνεργασία με οινοποιεία, ώστε να εξετασθούν οι μεταβολές στις πραγματικές βιομηχανικές συνθήκες οινοποίησης. Για τη διερεύνηση της μεταφοράς φαινολικών συστατικών από το σταφύλι (φλοιοί, σάρκα, γίγαρτα) στο κρασί, επιλέχθηκε ένας κλώνος της ποικιλίας της Μανδηλαριάς, η Μαυροκουντούρα Κύμης, η οποία δεν έχει εξετασθεί καθόλου, αν και αποτελεί μοναδική Ελληνική ποικιλία. Στη συνέχεια για τη μελέτη της εξέλιξης των υποομάδων των φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση, επιλέχθηκαν ποικιλίες που χρησιμοποιούνται σε ερυθρές και λευκές οινοποιήσεις, με διαφορετικές επεξεργασίες (απλή οινοποίηση, χρήση πηκτινολυτικών ενζύμων, κρυοεκχύλιση πριν τη ζύμωση) καθώς και διαφορετικούς χρόνους παραμονής των στεμφύλων με το ζυμούμενο γλεύκος (εκχύλισης φαινολικών συστατικών). Συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι ποικιλίες: Αγιωργίτικο, Μοσχοφίλερο, Ασύρτικο, Merlot, Syrah, και Cabernet. Οι δειγματοληψίες γινόταν σε όλη τη διάρκεια της οινοποίησης, ώστε να προσδιορισθεί η επίδραση όλων των σταδίων στις μεταβολές των φαινολικών συστατικών και να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την επίδραση αυτών, ανάλογα με τα απαιτούμενα ποιοτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος (χρώμα, οίνος παλαίωσης κλπ.). Τα φαινολικά συστατικά μεταφέρονται από τους φλοιούς και τα γίγαρτα στο ζυμούμενο γλεύκος κατά την διάρκεια παραμονής των στεμφύλων, στα αρχικά στάδια της ζύμωσης. Τα πιο πολικά συστατικά όπως είναι οι ανθοκυάνες, εκχυλίζονται ευκολότερα, ενώ οι φλαβαν-3-όλες ακολουθούν με πιο αργό ρυθμό και έπειτα από μια φάση υστέρησης. Σε όλες τις οινοποιήσεις το ολικό φαινολικό φορτίο έφτασε στην μέγιστη περιεκτικότητα μεταξύ 2-8 ημερών. Τόσο η διεργασία της κρυοεκχύλισης όσο και η προσθήκη των πηκτινολητικών ενζύμων ενίσχυσαν την ποσοτική εκχύλιση όλων των πολυφαινολών του σταφυλιού κατά την οινοποίηση. Επιπλέον, κατά την κρυοεκχύλιση, οπότε η αλκοολική ζύμωση είναι πολύ περιορισμένη λόγω χαμηλής θερμοκρασίας, αυξημένο ρυθμό διάλυσης παρουσίασαν τα πιο πολικά και υδατοδιαλυτά φαινολικά συστατικά, ενώ η εκχύλιση των φλαβαν-3-ολών σχεδόν αναστέλλεται. Επιπλέον στα Merlot και Syrah, που αποτελούν ευρύτατα οινοποιήσιμες ποικιλίες διεθνώς, εξετάσθηκε η μεταβολή της περιεκτικότητας μεταλλικών ιχνοστοιχείων σε συνάρτηση με τη μεταβολή φαινολικών συστατικών κατά την οινοποίηση. Παρατηρήθηκε μια αντίστροφη τάση μεταξύ της ποσοτικής μεταβολής πολυφαινολών και ιχνοστοιχείων. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε μείωση του Cu ταυτόχρονα με την εκχύλιση των ανθοκυανών και των φλαβονολών, η οποία και αποδόθηκε στη δημιουργία χηλικών συμπλόκων μεταξύ φλαβονοειδών και μετάλλων. Αντίστοιχη συμπεριφορά θα αναμενόταν και για τον Fe και το Mn όμως κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε ενώ η συγκέντρωση των συγκεκριμένων στοιχείων εμφάνισε αυξητική τάση, γεγονός που αποδόθηκε στη ύπαρξη οξειδίων τους σε σκευάσματα που προστέθηκαν κατά την οινοποίηση (ζύμες, πηκτινολητικά ένζυμα) και στη χρήση ανοξείδωτων δεξαμενών.Στα φρέσκα κρασιά έγινε προσπάθεια «χαρακτηρισμού» τους με βάση το φαινολικό προφίλ, μία τάση που αναπτύσσεται διεθνώς πρόσφατα για τη διάκριση μεταξύ των ποικιλιών και ως προς την εντοπιότητα των κρασιών. Ενδιαφέρον εμφάνισε ο υπολογισμός των λόγων των περιεκτικοτήτων κάποιων χαρακτηριστικών συνόλων υποκατεστημένων ανθοκυανών (π.χ. Σγλυκοζυλιωμένων/Σακετυλιωμένων), οι οποίοι επέτρεψαν ως ένα βαθμό τη διάκριση μεταξύ των ποικιλιών.Ο επόμενος βασικός στόχος της διατριβής ήταν η εξέταση των φαινολικών συστατικών κατά την αποθήκευση του κρασιού. Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης το ολικό φαινολικό φορτίο παρέμεινε πρακτικά σταθερό. Aκόμα και τα δείγματα που αποθηκεύτηκαν σε λεπτό στρώμα ατμοσφαιρικού αέρα, διατήρησαν σε χρονικό διάστημα ενός έτους, περισσότερο από το 80% της αρχικής συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών τους. Αντίθετα οι ελεύθερες ανθοκυάνες συμμετείχαν σε αντιδράσεις πολυμερισμού με τις φλαβαν-3-όλες και η συγκέντρωσή τους υποδεκαπλασιάστηκε σε διάστημα λίγων μηνών, ακολουθώντας κινητική πρώτης τάξης. Επίσης παρατηρήθηκε το φαινόμενο της ενζυμικής υδρόλυσης άλλων φαινολικών συστατικών, όπως είναι οι γλυκοζίτες των φλαβονολών και οι τρυγικοί εστέρες του κρασιού, οδηγώντας στην αύξηση των συγκεντρώσεων των αντιστοίχων αγλυκονών και των κινναμικών οξέων.Συνήθως για την αποθήκευση του κρασιού χρησιμοποιείται αδρανής ατμόσφαιρα, κυρίως με χρήση αζώτου, για περιορισμό των μικροβιακών αλλοιώσεων. Η επίδρασή της στα φαινολικά συστατικά του κρασιού, τα οποία είναι ευαίσθητα στην παρουσία οξυγόνου δεν έχει μελετηθεί. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε, εκτός του καθαρού αζώτου, διοξείδιο του άνθρακα ή μίγμα του με άζωτο, επειδή το διοξείδιο του άνθρακα είναι ένα φθηνό αέριο που παράγεται κατά την αλκοολική ζύμωση και τα φρέσκα κρασιά είναι σχεδόν κορεσμένα σε διοξείδιο του άνθρακα. Η αποθήκευση σε συνθήκες τροποποιημένης ατμόσφαιρας, εμφάνισε σημαντική επίδραση στην εξέλιξη των μονομερών ανθοκυανών, με τις σταθερές της κινητικής των δειγμάτων που αποθηκεύτηκαν σε τροποποιημένες ατμόσφαιρες να είναι έως και υποπενταπλάσιες σε σχέση με τα αντίστοιχα που αποθηκεύτηκαν παρουσία λεπτής στιβάδας ατμοσφαιρικού αέρα (-0.231 mon-1 έναντι -0.981 mon-1).Εκτός των μεταβολών των φαινολικών, μελετήθηκαν οι μεταβολές του χρώματος κατά την αποθήκευση και συσχετίσθηκαν με τα φαινολικά συστατικά, ώστε να ερμηνευθούν χρωματικές μεταβολές του κρασιού μέχρι την κατανάλωση. Όσον αφορά στις χρωματικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, το ολικό χρώμα (CI) και η λαμπρότητα (dA%) εμφάνισαν πτωτική τάση, ενώ αντίθετα η παράμετρος της απόχρωσης (Τ) αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης των κόκκινων κρασιών. Το λαμπερό κόκκινο χρώμα είναι επιθυμητό στους φρέσκους ερυθρούς οίνους, γι’ αυτό το λόγο επιδιώχθηκε η ενίσχυση του χρώματος με προσθήκη φυσικών συμπαραγόντων. Το φαινόμενο του σχηματισμού έγχρωμων συμπλόκων των ανθοκυανών, ευθύνεται για περισσότερο από 30% του χρώματος των φρέσκων κόκκινων κρασιών, ενώ κατά την αποθήκευση επικρατεί το χρώμα των πολυμερών που σχηματίζονται από τις αντιδράσεις των ανθοκυανών με τις φλαβαν-3-όλες. Ροσμαρινικό οξύ και φυσικά εκχυλίσματα πλούσια σε υδροξυκινναμικά οξέα, προερχόμενα από αρωματικά φυτά της οικογένειας Lamiaceae (Origanum vulgare και Satureja thymbra) εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να ενισχύσουν το χρώμα του φρέσκου κρασιού μέσω δημιουργίας έγχρωμων συμπλόκων με τις ανθοκυάνες. Η αύξηση του κόκκινου χρώματος, ήταν υψηλότερη με την προσθήκη των εκχυλισμάτων των φυτών σε σχέση με την προσθήκη πρότυπου ροσμαρινικού οξέος, γεγονός που αποδόθηκε στα φλαβονοειδή που περιέχονταν στα εκχυλίσματα, πέραν των κινναμικών οξέων. Παρατηρήθηκε η αύξηση του ολικού χρώματος του φρέσκου κρασιού κατά 15-50%, ενώ τα δείγματα στα οποία προστέθηκαν οι συμπαράγοντες από τα αρωματικά φυτά, διατήρησαν υψηλότερο φορτίο συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών και υψηλότερη χρωματική ένταση για χρονικό διάστημα 3 μηνών. Κατά την αποθήκευση του κρασιού, παρατηρήθηκε μείωση των μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών, με ταυτόχρονη αύξηση των πολυμερισμένων. Παρόλα αυτά η μεταβολή στην ισορροπία μεταξύ μονομερών και συμπλοκοποιημένων ανθοκυανών που επήλθε λόγο της προσθήκης των συμπαραγόντων από τα αρωματικά φυτά, δεν επηρέασε τον ρυθμό των αντιδράσεων πολυμερισμού κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης 6 μηνών.