Διερεύνηση της επίδρασης των κρυοσυντηρητικών μέσων στη βιωσιμότητα των εμβρύων: πειραματική μελέτη

Abstract

Purpose: of the current study is to investigate the effects of two cryoprotectant agents (DMSO and PrOH) that are used in vitirification. Blastomere/embryo viability and cytoskeletal integrity were examined at cleavage and morulla stage mouse embryos.Material: 240 embryos were flushed out of Background CBA/C57BL6J mouse oviducts. Sixty five of these embryos were fresh and used as controls, 90 embryos were vitrified with DMSO/EG and 85 with PrOH/EG. All embryos were divided into three subgroups depending on their developmental stage (4-6 cell, 8-cell and morulla).Methods: Vitrification of embryos with cryoprotectant DMSO / EG was performed using the Cook commercially available vitrification kit, while PrOH vitrification was performed with Vitrolife commercially available vitrification kit. Immediate blastomere and embryo viability following vitrification was assessed by labeling, with two fluorescent markers: carboxyfluorescein-diacetate succinimidylester (CFSE), which binds in the cytoplasm of viable cells and stains them green and propidium iodide (PI), which enters cells with damaged plasma membranes, binds to double stranded DNA in the nucleus and labels it red. Fresh and vitrified/warmed embryos were first incubated in CFSE and then transferred into a solution containing PI: CFSE/PBS and examined by fluorescence microscopy. Assessment of spindle chromosome configurations was performed using fluorescence and confocal microscopy, following immunostaining of embryos, using a primary monoclonal antibody specific for α-tubulin and a secondary antibody, which connected to primary and stained spindles green, whereas chromosomes were stained with DAPI in blue. Spindles were classified as normal, abnormal or multipolar, depending on the position or shape of their poles and on chromosome arrangement.Results: DMSO / EG vitrified mouse embryos had a significantly lower proportion of non-damaged blastomeres as compared to fresh embryos (54% vs. 91.1%). A significantly higher proportion of embryos with damaged blastomeres was observed in PrOH vitrified/warmed embryos as compared to fresh embryos (57.8% vs. 91.1%). No significant difference was observed in the proportion of embryos with non-damaged blastomeres amongst different stages of development in both the vitrified and the fresh embryos. Out of 20 fresh blastocysts, which were processed for cytoskeletal analysis, 17 (85%) had cells with mitotic spindles. In total, 36 spindles were analysed, of which 72.2% were normal, while the minority had abnormalities in the structure or the number of their poles. Cytoskeletal analysis showed 15/20 (75%) DMSO vitrified 8 cell embryos had cells with mitotic spindles. In total, 22 spindles were analysed, of which 45.5% were normal and 54.5% had abnormalities in the structure or the number of their poles. At the morula stage 14/20 (70%) DMSO vitrified embryos had cells with mitotic spindles. In total, 34 spindles were analysed, of which 50% were normal and 50% had abnormalities in the structure or the number of their poles. In the PrOH group, 15/20 (75%) of the vitrified embryos at the morula stage survived after thawing and 10/15 (66.7%) reached the blastocyst stage. However only 5/10 spindles were in the stages of metaphase-anaphase. At the 8 cell stage, 16/20 (80%) embryos survived thawing and 8/16 (50%) reached the blastocyst stage, but none of them had spindles at the metaphase – anaphase stages. Conclusions: All vitrified embryos survived thawing and no statistically significant difference was observed in the proportion of embryos with non-damaged blastomeres amongst different stages of development in both the vitrified and the fresh embryos. A significantly higher proportion of embryos with damaged blastomeres was observed in the vitrified/warmed embryos as compared to fresh embryos. The proportion of abnormal spindles was significantly higher in vitrified/warmed embryos as compared to fresh embryos (p≤0.05). The overall high survival rates following warming and the ability of the vast majority of embryos to develop to the blastocyst stage, suggest that embryos may compensate for a limited number of damaged cells and continue their development.

Σκοπός: της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της επίδρασης δύο κρυοπροστατευτικών μέσων, του DMSO και της PrOH που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο της υαλοποίησης. Εξετάστηκε η άμεση βιωσιμότητα των βλαστομεριδίων και των εμβρύων και η κυτταροσκελετική ακεραιότητα σε έμβρυα ποντικού που βρίσκονται στο στάδιο της αυλάκωσης και του μοριδίου. Υλικό: Eλήφθησαν 240 έμβρυα από έγκυα θηλυκά ζώα, φυλής background CBA/C57BL6J, από τα οποία τα 65 ήταν φρέσκα και χρησιμοποιήθηκαν σαν ομάδα ελέγχου, τα 90 υαλοποιήθηκαν με το κρυοπροστατευτικό μέσο DMSO και τα 85 με το κρυοπροστατευτικό μέσο PrOH. Όλα τα έμβρυα κατανεμήθηκαν σε τρεις υποομάδες, ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης των εμβρύων (4-6 κυττάρων/8 κυττάρων/μοριδίου).Μέθοδοι: Η υαλοποίηση των εμβρύων με το κρυοπροστατευτικό DMSO/EG πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο kit υαλοποίησης της Cook, ενώ με το PrOH χρησιμοποιήθηκε το kit υαλοποίησης της Vitrolife. Η άμεση βιωσιμότητα των βλαστομεριδίων και των εμβρύων μετά την υαλοποίηση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δύο φθορίζοντες δείκτες, τον σουκινιμυδυλικό εστέρα της διοξικής καρβοξυφλουορεσκεΐνης (CFSE) ο οποίος συνδέεται στο κυτταρόπλασμα των βιώσιμων κυττάρων και το χρωματίζει πράσινο και (2) το ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), το οποίο εισέρχεται μόνο σε μη βιώσιμα κύτταρα, χρωματίζοντας τα κόκκινα. Φρέσκα και υαλοποιημένα/αποψυγμένα έμβρυα τοποθετούνται άμεσα σε διάλυμα με CFSE και μετά σε CFSE/PI και εξετάζονται σε μικροσκόπιο φθορισμού. Για την αξιολόγηση της μιτωτικής ατράκτου και της διάταξης των χρωμοσωμάτων χρησιμοποιήθηκαν μικροσκόπιο φθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal) κατόπιν ανοσοϊστοχημικής χρώσης με ένα πρωτογενές μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για την α-τουμπουλίνη και ένα δευτερογενές αντίσωμα το οποίo συνδέεται στο πρωτογενές και χρωματίζει τις ατράκτους πράσινες, ενώ τα χρωμοσώματα χρωματίζονται με DAPI σε χρώμα μπλε. Οι άτρακτοι ταξινομήθηκαν ανάλογα με τη θέση ή το σχήμα των πόλων τους καθώς και τη διάταξη των χρωμοσωμάτων σε φυσιολογικές, ανώμαλου σχήματος και πολυπολικές.Αποτελέσματα: Όσον αφορά την άμεση βιωσιμότητα των φρέσκων και υαλοποιημένων εμβρύων ποντικού με DMSO/EG, τα υαλοποιημένα έμβρυα είχαν ένα σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό κυττάρων που δεν είχαν υποστεί βλάβη σε σχέση με τα φρέσκα έμβρυα (54% έναντι 91,1%). Ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των εμβρύων με κατεστραμμένα βλαστομερίδια, παρατηρήθηκε στα υαλοποιημένα / αποψυγμένα έμβρυα με PrOH/EG σε σύγκριση με τα φρέσκα έμβρυα (57,8% έναντι 91,1%). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό βλάβης των βλαστομεριδίων ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης, τόσο στα υαλοποιημένα όσο και στα φρέσκα. Από τις 20 φρέσκες βλαστοκύστεις, οι οποίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση του κυτταροσκελετού, 17 (85%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους. Συνολικά, μελετήθηκαν 36 άτρακτοι, εκ των οποίων 72,2% ήταν φυσιολογικές, ενώ η μειονότητα είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων τους. Στο στάδιο των υαλοποιημένων 8 κυττάρων με DMSO, 15 /20 έμβρυα (75%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους. Συνολικά, μελετήθηκαν 22 άτρακτοι, εκ των οποίων 45,5% ήταν φυσιολογικές και το 54,5% είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων τους. Τέλος στο στάδιο του μοριδίου, 14/20 υαλοποιημένα με DMSO έμβρυα (70%) είχαν κύτταρα με μιτωτικές ατράκτους και μελετήθηκαν 34 άτρακτοι, εκ των οποίων 50% ήταν φυσιολογικές, και 50% είχαν ανωμαλίες στη δομή ή στον αριθμό των πόλων. Στην ομάδα της PrOH, 15 από τα 20 (75%) υαλοποιημένα έμβρυα με PrOH στο στάδιο του μοριδίου επιβίωσαν μετά την απόψυξη και 10/15 (66,7%) έφτασαν στο στάδιο της βλαστοκύστης. Ωστόσο μόνο 5/10 είχαν ατράκτους στα στάδια της μετάφασης-ανάφασης. Στο στάδιο των 8 κυττάρων, 16 από τα 20 (80%) έμβρυα επιβίωσαν μετά την απόψυξη και 8/16 (50%) έφτασαν στο στάδιο της βλαστοκύστης αλλά κανένα από αυτά δεν είχε ατράκτους στα στάδια της μετάφασης – ανάφασης.Συμπεράσματα: Όλα τα υαλοποιημένα έμβρυα επιβίωσαν μετά την απόψυξη και δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό βλάβης των βλαστομεριδίων ανάμεσα στα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης των υαλοποιημένων και των φρέσκων εμβρύων. Tα υαλοποιημένα έμβρυα είχαν ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό βλαστομεριδίων που είχαν υποστεί βλάβη σε σχέση με τα φρέσκα έμβρυα. Το ποσοστό των μη φυσιολογικών ατράκτων ήταν σημαντικά υψηλότερο στα υαλοποιημένα έμβρυα σε σύγκριση με τα φρέσκα. Τα συνολικά υψηλά ποσοστά επιβίωσης μετά την απόψυξη και η ικανότητα της συντριπτικής πλειοψηφίας των εμβρύων να αναπτυχθούν μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης, υποδηλώνουν ότι τα έμβρυα έχουν τη δυνατότητα να ανέχονται έναν περιορισμένο αριθμό κυττάρων με βλάβη και συνεχίζουν την ανάπτυξη τους.