Investigation of the role of Nadph oxidase inhibitors in experimental animal models of retinopathies

Abstract

The retina constitutes a particularly complex tissue in which, the direct interaction and functional coupling of neurons, glial cells (macro/microglia) and vessels forms the Neurovascular Unit (NVU), important for the maintenance of retinal physiological function. Various pathological factors affect some or all of the components of the NVU, disrupting its function and causing the manifestation of retinal diseases (retinopathies). Diabetic Retinopathy (DR), the most commoncomplication of diabetes, affects a significant percentage of diabetes patients worldwide. Neurodegeneration, neuroinflammation and vasculopathy have been identified as the main components involved in the onset and development of DR, disrupting the function of the NVU. On the other hand, oxidative stress and glutamate excitotoxicity are interrelated mechanisms, directly involved in the manifestation of retinal disorders, including DR. NAPDH oxidases are enzymaticcomplexes (NOX family, seven known isoforms: NOX1-5, DUOX1/DUOX2) that represent one of the major sources of oxidative stress under pathological conditions in the retina, due to their sole role being the production of Reactive Oxygen Species. In different retinal cell types, the main isoforms NOX1,2 and 4 are expressed, which, in pathological conditions, have been associated with neurotoxic effects in the tissue. The aim of this PhD thesis was to evaluate the role of NADPH oxidases in the developmentof retinal disorders associated with excitotoxicity and diabetes, as well as the efficacy of specific NADPH oxidase inhibitors against neurodegeneration, neuroinflammation and vasculopathy, that characterize DR, essentially limiting the disruption of NVU and, therefore constituting a complete therapeutic approach for DR. For this purpose, two in vivo models were utilized in rats (Sprague-Dawley): 1) the model of AMPA induced excitotoxicity and 2) the model of streptozotocin (STZ) induced DR, in two paradigms, two and five weeks. In vivo model of AMPA excitotoxicity: the specific NOX2 inhibitor, GLX7013170, or the specific NOX4 inhibitor, GLX7013114, were co-administered with AMPA (8.4mM) intravitreally at the dose of 10-4M. Twenty-four hours (24 h) after the injections, eyes were isolated and tissues were collected for immunohistochemical studies. In vivo model of STZ induced DR: diabetes was induced by intraperitoneal injection of STZ (70mg/ml) andtreatment included the topical administration as eye drops (20μl/drop) of each substance tested(pan-NOX inhibitor: VAS2870, NOX4 inhibitor : GLX7013114, NOX2 inhibitor: GLX7013170), at the concentration of 10mg/ml, either 1) once daily, for a total duration of 14 days, starting 48 hours after STZ administration (two-week paradigm) or 2) once daily, for 7 days in total, starting 4 weeks after STZ administration (five-week paradigm). Twenty-four hours after the last day of treatment, tissues were collected for further use in various techniques, which included: immunohistochemistry, western blot, Real Time PCR, ELISA and Evans-Blue analysis, as well as Pattern Electroretinogram (PERG). Moreover, a pharmacokinetic study of the NOX4 inhibitor, GLX7013114, was performed, where the levels of GLX7013114 in the retina of healthy rats were determined through LC-MS/MS analysis. In the AMPA excitotoxicity model, AMPA administration was associated with the induction of oxidative damage in retinal tissue, which was significantly reduced by the NOX4 inhibitor. In addition, both NOX2/NOX4 inhibitors examined, GLX7013170 and GLX7013114, respectively, significantly reduced macro/microglia activation, while only the NOX2 inhibitor provided protection to the NOS positive amacrine cells against AMPA induced excitotoxicity. In the model of STZ induced DR, diabetes caused an increase in NOX2 and NOX4 isoform mRNA expression in the retina in the two-week paradigm, while in the five-week paradigm the expression of the NOX2 isoform was increased, in contrast with the significant reduction of NOX1 isoform mRNA. In the same paradigm, general NOX inhibition (VA2870) was associated with protection of ganglion cell axons, as well as reduced activation of micro/macroglia, an effect also observed in the case of NOX2 inhibitor, GLX7013170. However, the NOX2 inhibitor did not provide any protection at the level of ganglion cell axons, although it was found to regulate Bcl-2 protein expression in the retina of diabetic rats. Administration of the NOX4 inhibitor, GLX7013114, resulted in: 1) reduction of oxidative damage, caspase-3 expression, the loss of NOS amacrine cells and ganglion cell axons and micro/macroglial activation in both paradigms examined. GLX7013114 also significantly reduced the expression of TNF-α in the two-week paradigm, while in the five-week paradigm it reduced the expression of VEGF and IL-1β/IL-6 (mRNA), vascular leakage and protected ganglion cell function as revealed by PERG analysis of amplitudes recorded. In addition, the pharmacokinetic study of the NOX4 inhibitor, GLX7013114, confirmed that this inhibitor, administered topically as eye drops, reaches the retina and remains at detectable levels for up to 8 hours, justifying its therapeutic effects. In conclusion, NADPH oxidases are involved in the onset of excitotoxic phenomena in the retina, while at the same time their expression in retinal tissue is differentially affected by diabetes (NOX1,2 and 4). AMPA excitotoxicity is correlated with the induction of oxidative damage in the retina. NOX inhibitors can act as neuroprotective (NOX2 inhibitor) and anti-inflammatory agents (NOX2 and NOX4 inhibitor) against AMPA excitotoxicity. NOX2 and NOX4 isoforms are both involved in the development of retinal complications in the early stages of DR, which makes their inhibitors promising therapeutic targets. In particular, the extensive study of NOX4 inhibitor, GLX7013114, in both paradigms of DR, in combination with the pharmacokinetic analysis, support its efficacy to act against neurodegeneration, neuroinflammation and vasculopathy, constituting a complete therapeutic approach for the treatment of the early stage of DR.

Ο αμφιβληστροειδής είναι ένας ιδιαίτερα σύνθετος ιστός στον οποίο, η άμεση αλληλεπίδραση και λειτουργική σύζευξη νευρώνων, κυττάρων γλοίας (μακρο/μικρογλοία) και αγγείων διαμορφώνει την Νευροαγγειακή Μονάδα, απαραίτητη για τη διατήρηση της φυσιολογικής δομής και λειτουργίας του. Επιμέρους παθολογικοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν κάποιο ή και όλα τα συστατικά της Νευροαγγειακής Μονάδας, διαταράσσοντας την ομαλή λειτουργία της και προκαλώντας την εκδήλωση αμφιβληστροειδοπαθειών. Η Διαβητική Αμφιβληστροειδοπάθεια (ΔΑ), κύρια επιπλοκή του διαβήτη, επηρεάζει σημαντικό ποσοστό ασθενών με διαβήτη παγκοσμίως. Η νευροεκφύλιση, η φλεγμονή και η αγγειοπάθεια έχουν αναγνωριστεί ως οι κύριες συνιστώσες που ενέχονται στην εκδήλωση και ανάπτυξη ΔΑς, διαταράσσοντας τη λειτουργία της Νευροαγγειακής Μονάδας. Από την άλλη πλευρά, το οξειδωτικό στρες και η διεργετοξικότητα γλουταμικού εμπλέκονται άμεσα στην εκδήλωση διαταραχών στον αμφιβληστροειδή, συμπεριλαμβανομένης της ΔΑς και μάλιστα, αποτελούν μηχανισμούς αλληλένδετους. Οι NAPDH οξειδάσες είναι ενζυμικά σύμπλοκα (οικογένεια ΝΟΧ, επτά αναγωρισμένες ισομορφές: ΝΟΧ1-5, DUOX1/DUOX2) υπεύθυνα για την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου και αποτελούν μία από τις κύριες πηγές οξειδωτικού στρες σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις του αμφιβληστροειδή. Σε επιμέρους αμφιβληστροειδικούς κυτταρικούς τύπους εκφράζονται οι κύριες ισομορφές ΝΟΧ1,2 και 4, οι οποίες, σε παθολογικές συνθήκες έχουν συσχετιστεί με φαινόμενα νευροτοξικότητας στον ιστό. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να αξιολογηθεί ο ρόλος των NADPH οξειδασών στην εκδήλωση διαταραχών στον αμφιβληστροειδή που σχετίζονται με τη διεγερτοτοξικότητα γλουταμικού και το διαβήτη, καθώς και η αποτελεσματικότητα ειδικών αναστολέων των NADPH οξειδασών έναντι στη νευροεκφύλιση, τη φλεγμονή και την αγγειοπάθεια που εκδηλώνονται στη ΔΑ, περιορίζοντας ουσιαστικά τη διαταραχή της Νευροαγγειακής Μονάδας κι επομένως αποτελώντας ολική θεραπευτική προσέγγιση αντιμετώπισης της ΔΑς. Για το σκοπό αυτό, αξιοποιήθηκαν συνολικά δύο in vivo μοντέλα σε επίμυες (Sprague-Dawley): 1) το μοντέλο της επαγόμενης μέσω AMPA διεγερτοτοξικότητας και 2) το μοντέλο της επαγόμενης μέσω στρεπτοζοτοκίνης (ΣΤΖ) ΔΑς, σε δύο παραλλαγές, των δύο και των πέντε εβδομάδων. In vivo μοντέλο AMPA διεγερτοτοξικότητας: ο ειδικός ΝΟΧ2 αναστολέας, GLX7013170, ή ο ειδικός NOX4 αναστολέας, GLΧ7013114, συγχορηθήκαν μαζί με το AMPA(8.4mM) ενδοϋαλοειδικά, στη δόση των 10-4Μ. Εικοσιτέσσερις ώρες (24 ώρες) μετά τις χορηγήσεις απομονώθηκαν οι οφθαλμοί και συλλέχθηκαν οι ιστοί για ανοσοϊστοχημικές μελέτες. In vivoμοντέλο επαγόμενης μέσω ΣΤΖ ΔΑς: ο διαβήτης προκλήθηκε μέσω ενδοπεριτοναϊκής χορήγησης ΣΤΖ (70mg/ml) και η θεραπεία περιελάμβανε την τοπική χορήγηση υπό μορφή οφθαλμικών σταγόνων (20μl/σταγόνα) της εκάστοτε εξεταζόμενης ουσίας (pan-NOX αναστολέας: VAS2870, NOX4 αναστολέας: GLX7013114, NOX2 αναστολέας: GLX7013170), στη συγκέντρωση των 10mg/ml, είτε 1) μία φορά καθημερινά, για 14 μέρες συνολικά, ξεκινώντας 48 ώρες μετά τη χορήγηση της ΣΤΖ (παραλλαγή των δύο εβδομάδων) ή 2) μία φορά καθημερινά, για 7 συνολικά μέρες, ξεκινώντας 4 εβδομάδες μετά τη χορήγηση της ΣΤΖ (παραλλαγή των πέντε εβδομάδων). Σε κάθε περίπτωση, 24 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση της θεραπείας, οι ιστοί συλλέχθηκαν προκειμένου να αξιοποιηθούν σε επιμέρους τεχνικές, που περιελάμβαναν: ανοσοϊστοχημεία, αναλύσεις western blot, Real Time PCR, ELISA και Evans-Blue, καθώς και ηλεκτροαμφιβληστροειδογράφημα προκαλούμενο από οπτικό ερέθισμα (Pattern Electroretinogram, PERG). Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε φαρμακοκινητική μελέτη του NOX4 αναστολέα, GLX7013114, με προσδιορισμό των επιπέδων του στον αμφιβληστροειδή υγιών αρουραίων μέσω LC-MS/MS ανάλυσης. Στο μοντέλο της AMPA διεγερτοτοξικότητας, η χορήγηση του AMPA συσχετίστηκε με την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στον ιστό, φαινόμενο το οποίο περιορίστηκε σημαντικά μέσω του NOX4 αναστολέα. Παράλληλα, και οι δύο εξεταζόμενοι αναστολείς, ΝΟΧ2/ΝΟΧ4, GLX7013170 και GLX7013114, αντίστοιχα, περιόρισαν σημαντικά την ενεργοποίηση της μακρο/μικρογλοίας, ενώ μόνο ο ΝΟΧ2 αναστολέας παρείχε προστασία των NOS θετικών αμακρυνικών κυττάρων του ιστού έναντι της AMPA επαγόμενης διεγερτοτοξικότητας. Στο μοντέλο της επαγόμενης μέσω ΣΤΖ ΔΑς, ο διαβήτης προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του mRNA της ΝΟΧ2 και ΝΟΧ4 ισομορφής στον αμφιβληστροειδή, στην παραλλαγή των δύο εβδομάδων, ενώ στην παραλλαγή των πέντε εβδομάδων αυξημένη ήταν η έκφραση της ΝΟΧ2 ισομορφής, με την ΝΟΧ1 να παρουσιάζει στατιστικώς σημαντική μείωση. Στην ίδια παραλλαγή, η γενική ΝΟΧ αναστολή (VAS2870) συσχετίστηκε με προστασία των αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων, καθώς και με μειωμένη ενεργοποίηση της μικρο/μακρογλοίας, αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε και κατά τη χορήγηση του ΝΟΧ2 αναστολέα, GLX7013170. Ωστόσο, ο ΝΟΧ2 αναστολέας δεν παρείχε καμία προστασία σε επίπεδο αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων, αν και βρέθηκε να ρυθμίζει την έκφραση της Bcl-2 πρωτεΐνης στον αμφιβληστροειδή των διαβητικών επίμυων. Ο NOX4 αναστολέας, GLX7013114, οδήγησε σε: 1) μείωση της οξειδωτικής βλάβης, της έκφρασης της κασπάσης-3, της απώλειας των NOS θετικών αμακρυνικών κυττάρων και των αξόνων των γαγγλιακών κυττάρων και της ενεργοποίησης μικρο/μακρογλοίας και στις δύο εξεταζόμενες παραλλαγές. Συγχρόνως, περιόρισε σημαντικά την έκφραση του παράγοντα TNF-α στην παραλλαγή των δύο εβδομάδων, ενώ στην παραλλαγή των πέντε εβδομάδων περιόρισε την έκφραση του παράγοντα VEGF και των κυτοκικών IL-1β/IL-6 (mRNA), την αγγειακή διαρροή και προστάτευσε και τη λειτουργία των γαγγλιακών κυττάρων, όπως φανερώνει η ανάλυση του εύρους των καταγραφών της μελέτης PERG. Επιπρόσθετα, η φαρμακοκινητική μελέτη του ΝΟΧ4 αναστολέα, GLX7013114, επιβεβαίωσε ότι ο συγκεκριμένος αναστολέας, χορηγούμενος τοπικά υπό μορφή οφθαλμικών σταγόνων, φτάνει στον αμφιβληστροειδή και παραμένει σε ανιχνεύσιμα επίπεδα μέχρι και για 8 ώρες, ενισχύοντας τα προηγούμενα θεραπευτικά του αποτελέσματα. Συμπερασματικά, οι NADPH οξειδάσες εμπλέκονται στην εκδήλωση φαινομένων διεγερτοτοξικότητας στον αμφιβληστροειδή, ενώ παράλληλα η έκφρασή τους στον ιστό επηρεάζεται διαφορετικά από το διαβήτη (ΝΟΧ1,2 και 4). Η AMPA διεγερτοτοξικότητα σχετίζεται με την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στον ιστό και οι ΝΟΧ αναστολείς μπορούν να δράσουν ως νευροπροστατευτικοί (ΝΟΧ2 αναστολέας) και αντιφλεγμονώδεις παράγοντες (ΝΟΧ2 και ΝΟΧ4 αναστολέας) έναντι αυτής. Οι NOX2 και NOX4 ισομορφές εμπλέκονται αμφότερες στις επιπλοκές που εκδηλώνονται στον αμφιβληστροειδή στα πρώιμα στάδια ΔΑς, γεγονός που καθιστά τους αναστολείς τους υποσχόμενα μόρια αντιμετώπισής της. Ειδικότερα για τον ΝΟΧ4 αναστολέα, GLX7013114, η εκτενής μελέτη του και στις δύο παραλλαγές της ΔΑς, σε συνδυασμό με την φαρμακοκινητική ανάλυση, υποστηρίζουν την ικανότητά του να δράσει συγχρόνως έναντι στη νευροεκφύλιση, τη φλεγμονή κα την αγγειοπάθεια, αποτελώντας ολική θεραπευτική προσέγγιση αντιμετώπισης των πρώιμων σταδίων ΔΑς.