Μελέτη της φαρμακοκινητικής και της ενδεχόμενης αμφιβληστροειδικής τοξικότητας πρωτότυπων συνθετικών νευροστεροειδών μορίων με νευροπροστατευτική δράση

Abstract

BNN27 is a novel synthetic 17-spiroepoxy derivative of the neurosteroid Dehydroepiandrosterone (DHEA). It is one of a series of newly synthesized synthetic derivatives of DHEA, named BNN, which are small lipophilic molecules with antiapoptotic properties, without the undesirable estrogenic effect of DHEA. More specifically, it is one of the three BNNs (BNN20, 23 and 27), which were found to have the most potent neuroprotective and antiapoptotic activity. In the present thesis, BNN27 was chosen to be studied as it is the most widely used in preclinical studies, among the three lead molecules so far, but also the molecule that has been used in the. The purpose of this research was to study the pharmacokinetic characteristics of BNN27, both after systemic and local administration, in the blood, but also in the target- tissue, the posterior segment of the eye (vitreous and retina), as well as to assess for any retinal toxicity after local administration. After the initial spectroscopic characterisation of the three lead BNNs, BNN20, 23 and 27, the BNN27 pharmacokinetics were studied, both after systemic- intraperitoneal administration, in the serum and in the target-tissue, the retina, as well as after local- intravitreal (IVT) administration in the vitreous. Moreover, the presence of retinal toxicity after intravitreal administration was investigated. For the serum pharmacokinetics, 42 C57BL/6 mice were used. The blood was collected post-orbitarily at time points 0, 30 min, 1h, 2, 4, 6 and 24h after one intraperitoneal injection of 100mg/kg BNN27 and the concentrations were measured by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The molecule was found to have an elimination constant kel=0.465h^(-1) and mean residence time (MRT) = 2.154h in the mice serum. For the retinal pharmacokinetics, 48 Sprague-Dawley rats were used. The retina was isolated, after enucleation, at 0, 15, 30min, 1h, 1h, 2, 4, 6 and 24h after one intraperitoneal injection of 30mg/kg BNN27 and the concentrations were measured by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). The first time point of BNN27 detection in the retinal tissue were the 30 minutes after injection. The time of the maximum measured concentration (tcmax) was 2 hours and the maximum concentration was found to be Cmax=1100ng/g. BNN27 was detected in the retina even after transcardiac perfusion with Ringer's Lactate (RL), with a 2h post-injection concentration equal to 320 (70) ng/g. For the vitreous pharmacokinetics, both eyes of 21 albino rabbits received one intravitreal injection of 0.6mg/0.1ml BNN27. The vitreous was isolated after enucleation, at time points 0 (euthanasia and enucleation immediately after injection), 12 h, 1 day, 2, 7, 14 and 30 days after one intravitreal injection of 6mg/ml BNN27 and concentrations were measured by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). BNN27 was shown to follow 1st order kinetics, with an elimination constant kel = 0.15h^(-1) and a half-life of 4.49 days. At 30 days, traces of BNN27 were detected. To assess for any retinal toxicity, two intravitreal concentrations of BNN27 were examined: 6mg/ml (group A) and 0.6mg/ml (group B). Each group comprised of 12 pigmented rabbits. Τhe right eye of each animal was injected with 0.1ml of the respective BNN27 concentration (study eye) and the left eye was injected with 0.1ml of a 6% ethanol solution (control eye-positive control), in both groups. The animals were examined at time points: 0 (before injection), 1 day, 1 week, 2 weeks and 1 month after injection. During the experiment, the eyes were monitored macroscopically, with slit-lamp anterior segment examination, fundoscopy and tonometry. At the end of the experiment (30 days after injection), the eyes were studied histologically, with photon microscopy, after enucleation and appropriate preparation. The retinal function was studied with electroretinography (ERG) before injection and one month after the intravitreal injection. In group A, two study eyes presented macroscopic, histological and functional findings of posterior segment inflammation and this was potentially associated with the BNN27 solution. In both groups, non-specific histological findings were observed, which were not confirmed by ERG; they are not most likely associated with the BNN27. Furthermore, in both groups, the control eyes did not show any signs of toxicity, anatomical or functional. In conclusion, BNN27 was proved to move rapidly from the intraperitoneal space into the systemic circulation and thence into the retina. This is consistent with the size and lipophilicity of the molecule. The detection of intraretinal BNN27, after transcardiac RL perfusion, proved that BNN27 can cross the blood-retinal barrier. In addition, given the long -term detection of the BNN27 in the vitreous after IVT administration, the present formulation could be potentially considered for the BNN27’s slow release to the retina, in case of future clinical use. Eventually, the low dose appears to be relatively safe for intravitreal use and ethanol can be safely used for the BNN27 dilution at 6% v/v concentration.

Το ΒΝΝ27 είναι ένα πρωτόλειο συνθετικό 17-spiroepoxy παράγωγο του νευροστεροειδούς Δεϋδροεπιανδροστερόνης (Dehydroepiandrosterone, DΗΕΑ). Αποτελεί το ένα από μια ολόκληρη σειρά νεοσυντεθιμένων συνθετικών παραγώγων της DΗΕΑ, τα οποία ονομάστηκαν ΒΝΝ και είναι μικρά λιπόφιλα μόρια, με αντιαποπτωτικές ιδιότητες, χωρίς την ανεπιθύμητη οιστρογονική δράση της DHEA. Πιο συγκεκριμένα, είναι ένα από τα τρία ΒΝΝ (ΒΝΝ20, 23 και 27), τα οποία βρέθηκαν να έχουν την πιο ισχυρή νευροπροστατευτική και αντιαποπτωτική δράση. Στην παρούσα διατριβή, επιλέχθηκε το ΒΝΝ27, γιατί είναι το ΒΝΝ που έχει μελετηθεί σε πειραματικά ζωικά μοντέλα αμφιβληστροειδικών παθήσεων, ενώ είναι και το πιο πολυχρησιμοποιημένο ΒΝΝ, στις μέχρι τώρα προκλινικές μελέτες, συνολικά.Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η μελέτη των φαρμακοκινητικών χαρακτηριστικών του BNN27, τόσο μετά από συστηματική όσο και μετά από τοπική χορήγηση, τόσο στο αίμα όσο και στο όργανο στόχο, το οπίσθιο ημιμόριο του οφθαλμού (υαλοειδές και αμφιβληστροειδής), καθώς και η διερεύνηση πιθανής τοξικότητας του μορίου στον αμφιβληστροειδή, μετά από τοπική χορήγηση.Αρχικά, περιεγράφηκαν φασματοσκοπικά τα τρία βασικά ΒΝΝ, ΒΝΝ20, 23 και 27. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η φαρμακοκινητική του ΒΝΝ27 τόσο μετά από συστηματική- ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση, στον ορό του αίματος και στο όργανο στόχο, τον αμφιβληστροειδή, όσο και μετά από τοπική- ενδοϋαλοειδική χορήγηση, στο υαλοειδές σώμα. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η ύπαρξη ενδεχόμενης αμφιβληστροειδικής τοξικότητας έπειτα από ενδοϋαλοειδική χορήγηση του ΒΝΝ27. Για την κινητική στο αίμα, χρησιμοποιήθηκαν 42 C57BL/6 μύς. Χορηγήθηκε μία ενδοπεριτοναϊκή ένεση 100mg/kg β.σ. ΒΝΝ27. Το αίμα συλλέχθηκε οπισθοβολβικά στις χρονικές στιγμές 0, 30 λεπτά, 1ώρα, 2, 4, 6 και 24ώρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Το μόριο βρέθηκε να έχει σταθερά απομάκρυνσης (elimination constant) kel=0.465h^(-1) και χρόνο μέσης παραμονής (Mean Residence Time) MRT=2.154 ώρες στον ορό του αίματος του μυός. Για την κινητική στον αμφιβληστροειδή, έγινε μία ενδοπεριτοναϊκή έγχυση 30mg/kg β.σ. σε 48 Sprague-Dawley επίμυες. Ο αμφιβληστροειδής απομονώθηκε με κατάλληλη τεχνική, μετά από εξόρυξη των οφθαλμών στις χρονικές στιγμές 0, 15, 30λεπτά, 1ώρα, 2, 4, 6 και 24 ώρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Η πρώτη χρονική στιγμή ανίχνευσης του ΒΝΝ27 στον αμφιβληστροειδή ήταν τα 30 λεπτά. Η χρονική στιγμή της μέγιστης μετρούμενης συγκέντρωσης (tcmax) ήταν οι δύο ώρες και η μέγιστη συγκέντρωση βρέθηκε ίσης με Cmax=1100ng/g. Το ΒΝΝ27 ανιχνεύτηκε στον αμφιβληστροειδή ακόμα και μετά από απομάκρυνση του αίματος από τη συστηματική κυκλοφορία, με τροποποιημένη διακαρδιακή έγχυση με ισοτονικό διάλυμα Ringer’s Lactate (RL) με μετρούμενη συγκέντρωση στις 2 ώρες τα 320(70) ng/g. Για τη μελέτη της κινητικής στο υαλοειδές, έγινε μία ενδοϋαλοειδική ένεση 6mg/ml ΒΝΝ27 σε αμφότερους τους οφθαλμούς 21 αλφικών κονίκλων. Το υαλοειδές απομονώθηκε με κατάλληλη τεχνική, μετά από εξόρυξη των οφθαλμών στις χρονικές στιγμές 0 (ευθανασία αμέσως μετά την έγχυση), 12 ώρες, 1, 2, 7, 14 και 30 ημέρες μετά την έγχυση και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με υγρή χρωματογραφία-φασματοσκοπία μάζας (Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS). Η απομάκρυνση του ΒΝΝ27 από το υαλοειδές βρέθηκε να ακολουθεί κινητική 1ης τάξης, με σταθερά απομάκρυνσης kel= 0.15h^(-1) και χρόνο ημίσειας ζωής τις 4.49 ημέρες. Για τη διερεύνηση της αμφιβληστροειδικής τοξικότητας, ελέγχθηκαν δύο ενδοϋαλοειδικές συγκεντρώσεις ΒΝΝ27: 6mg/ml (ομάδα Α) και 0.6mg/ml (ομάδα Β). Σε αμφότερες τις ομάδες, εγχύθηκε ενδοϋαλοειδικά 0.1ml μίγματος ΒΝΝ27 της αντίστοιχης συγκέντρωσης, στον δεξιό οφθαλμό (οφθαλμός μελέτης) 12 κονίκλων με φυσιολογική χρωστική και 0.1 ml διαλύματος 6% αιθυλικής αλκοόλης στον αριστερό οφθαλμό και των δύο ομάδων (οφθαλμός ελέγχου-θετικός μάρτυρας). Ελέγχθηκαν οι χρονικές στιγμές 0 (πριν την έγχυση), 1 μέρα, 1 εβδομάδα, 2 εβδομάδες και 1 μήνας μετά την έγχυση. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, χρησιμοποιήθηκαν μακροσκοπικές τεχνικές παρακολούθησης (σχισμοειδής λυχνία, βυθοσκόπηση, τονομέτρηση). Μετά το τέλος του πειράματος, οι οφθαλμοί μελετήθηκαν ιστολογικά, με φωτονικό μικροσκόπιο, μετά από εξόρυξη και κατάλληλη προετοιμασία. Η λειτουργική ακεραιότητα του αμφιβληστροειδή μελετήθηκε με αμφιβληστροειδογράφημα (ΗΑΓ), πριν την έγχυση και ένα μήνα μετά την έγχυση, πριν την ευθανασία. Στην ομάδα Α παρατηρήθηκαν ανατομικά και λειτουργικά ευρήματα ενδοϋαλοειδικής φλεγμονής σε 2 οφθαλμούς μελέτης, τα οποία πιθανά να σχετίζονται με το υπό μελέτη κολλοειδές του ΒΝΝ27. Στην ομάδα Β, δεν παρατηρήθηκαν ευρήματα τοξικότητας του ΒΝΝ27. Σε αμφότερες τις ομάδες, παρατηρήθηκαν μικροσκοπικές αλλοιώσεις, μη σχετιζόμενες με το υπό μελέτη μόριο, που δεν επιβεβαιώθηκαν ηλεκτροφυσιολογικά. Οι οφθαλμοί μάρτυρες αμφότερων των ομάδων δεν εμφάνισαν σημεία τοξικότητας. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι το ΒΝΝ27 μετακινείται ταχέως από τον ενδοπεριτοναϊκό χώρο στο αίμα και από κει στον αμφιβληστροειδή. Δεδομένου του μεγέθους και της λιποφιλικότητας του μορίου, κάτι τέτοιο ήταν αναμενόμενο. Το ΒΝΝ27 αποδείχθηκε ότι διέρχεται τον αιματοαμφιβληστροειδικό φραγμό με την ανίχνευσή του στον ιστό, μετά τη διακαρδιακή έγχυση RL. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι η συγκεκριμένη φαρμακοκινητική μορφή του ΒΝΝ27 μπορεί να λειτουργήσει ως δεξαμενή για την βραδεία απόδοση του μορίου στον αμφιβληστροειδή, σε πιθανή κλινική του χρήση. Τέλος, η χαμηλή δόση φαίνεται να είναι σχετικά ασφαλής για ενδοϋαλοειδική χρήση και η αιθανόλη μπορεί να χρησιμοποιηθεί με ασφάλεια για την αραίωση του BNN27 στη συγκέντρωση 6% v/v.