Εφαρμογές του Gefitinib και συμπλοκών μικροεγκλεισμού Gefitinib κυκλοδεξτρινών: φυσικοχημικές ιδιότητες των φαρμάκων και μελέτη της δράσης τους σε κυτταρικές σειρές συμπαγών όγκων της παιδικής ηλικίας

Abstract

In the current work, we focused on the study of the effect of gefitinib in the presence or absence of cyclodextrins (CyDs), in neuroblastoma and glioblastoma cell lines, using biological assays. Also, we studied its inhibitory activity on EGFR tyrosine kinase domain of the receptor. In addition, we investigated the physicochemical and structural characteristics of gefitinib-cyclodextrin inclusion complexes, using complementary biophysical methods.We used neuroblastoma (SH-SY5Y, BE(2)M17) and glioblastoma (A172) cell lines , which were exposed to various concentrations of gefitinib, CyDs and gefitinib-cyclodextrin inclusion complexes (HP-β-CyD, DIMEB/TRIMEB). Cytotoxicity was assessed with alamar blue assay. EGFR expression was evaluated with immunohistochemistry and tyrosine phosphorylation of EGFR in the presence of gefitinib with ELISA assays.NMR spectra, allowed the elucidation of the structure of complexes (gefitinib/2-hydroxypropyl-β-CD, gefitinib/DIMEB, gefitinib/TRIMEB) in solution. Molecular modelling calculations and molecular dynamics simulations were made to predict the energy minimized structures of the complexes. In immunohistochemistry we observed that SH-SY5Y cells expressed higher levels of EGFR. ELISA assays in both cell lines showed gradual increase in EGFR tyrosine phosphorylation, as the concentration of gefitinib decreased, whilst EGFR levels were not altered. In alamar blue assay we observed that as the exposure time and as the concentration of gefitinib and gefitinib- β-CyDs complexes increased, cell viability decreased. The gefitinib/HP-β-CyD was the most effective combination in all tested concentrations. On the contrary, DIMEB/TRIMEB and HP-β-CyD did not have any effect on cell viability, except for the highest concentrations.With NMR we verified that the chlorofluorophenyl ring of gefitinib was included in the cavity of the CyDs and its solubility reached ~1.5 mM, 1.8 mM and 0.2 mM, in the presence of DIMEB, TRIMEB and HP-β-CyD, respectively.Gefitinib is insoluble to water and thus its reduced bioavailability is a very important issue in the treatment of cancer. In order to improve its low solubility, we obtained inclusion complexes of gefitinib with CyDs. We observed that gefitinib/DIMEB/TRIMEB and gefitinib/HP-β-CyD complexes were more effective in a time- and dose-dependent manner in all cell lines, when compared with the sole use of gefitinib. This could be attributed to the inclusion of the most hydrophobic part of gefitinib in the cavity of CyDs. In agreement with previous studies, we showed that the inhibition of EGFR could be an effective cytotoxic choice, especially in cancer cells lines which exhibit overexpression of EGFR or expression of mutated forms of EGFR.

Στην παρούσα μελέτη: α) Διερευνήθηκε η δραστικότητα της γεφιτινίμπης σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστώματος (Α172) και νευροβλαστώματος (SH-SY5Y, BE(2)M17) και η συσχέτιση της συγκέντρωσής της με την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της φωσφορυλίωσης στην τυροσινική κινάση του υποδοχέα του επιδερμιδικού αυξητικού παράγοντα EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). β) Πραγματοποιήθηκε μικροεγκλεισμός της γεφιτινίμπης σε β-κυκλοδεξτρίνες (CyDs) (DIMEB/TRIMEB, 2-υδροξυ-προπυλιωμένη-β-CyD) για βελτίωση της υδατοδιαλυτότητάς της. γ) Μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των προϊόντων εγκλεισμού και η δραστικότητά τους σε κύτταρα νευροβλαστώματος. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων γεφιτινίμπης, CyDs και προϊόντων εγκλεισμού εκτιμήθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο κυανούν alamar. Η φωσφορυλίωση του καταλοίπου τυροσίνης Tyr 1068 του EGFR εκτιμήθηκε με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA και τα επίπεδα έκφρασης του EGFR στα κύτταρα με ανοσοϊστοχημεία. Με τη φασματοσκοπία NMR αναδείξαμε τον τρόπο εγκλεισμού της γεφιτινίμπης στις CyDs. Με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής αναπαραστήσαμε την τρισδιάστατη μοριακή δομή και μιμηθήκαμε τη συμπεριφορά των προϊόντων εγκλεισμού. Η σειρά SH-SY5Y εκφράζει υψηλότερα επίπεδα EGFR. Στην ELISA παρατηρήθηκε μείωση της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 1068 του EGFR, καθώς αυξανόταν η συγκέντρωση της γεφιτινίμπης, ενώ τα επίπεδα του EGFR δεν επηρεάζονταν. Στη δοκιμασία κυανούν alamar, καθώς αυξανόταν η συγκέντρωση της γεφιτινίμπης και των συμπλόκων εγκλεισμού και ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων στα φάρμακα παρατηρήθηκε ελάττωση της κυτταρικής βιωσιμότητας, ιδίως σε έκθεση στο γεφιτινίμπη/2-υδροξυ-προπυλιωμένη-β-CyD. Αντίθετα, η έκθεση των κυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις κυκλοδεξτρινών δεν είχε επίδραση στα κύτταρα, με εξαίρεση τις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Με φασματοσκοπία NMR επιβεβαιώσαμε το σχηματισμό προϊόντων εγκλεισμού της γεφιτινίμπης με τις β-CyDs σε υδατικό διάλυμα και την αύξηση της διαλυτότητάς της, μετά τον εγκλεισμό, καθώς είναι πλήρως αδιάλυτη σε νερό. Παρουσία των DIMEB, TRIMEB και 2-υδροξυ-προπυλιωμένης-β-CyD η διαλυτότητά της αυξήθηκε σε ~1,5 mM, ~1,8 mM και 0,2 mM, αντίστοιχα. Στα πειράματα μοριακής δυναμικής η ενέργεια της καλύτερης διαμόρφωσης των συμπλόκων εγκλεισμού υπολογίσθηκε ΔG0=-4, 6kcal/mol, -4,2kcal/mol και -4,6kcal/mol στα γεφιτινίμπη/DΙMEB, γεφιτινίμπη /TRIMEB και γεφιτινίμπη/2-υδροξυ-προπυλιωμένη-β-CyD, αντίστοιχα. Αποδείξαμε ότι η γεφιτινίμπη και τα προϊόντα εγκλεισμού της έχουν κυτταροτοξική δράση σε κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος και γλοιοβλαστώματος. Τα προϊόντα εγκλεισμού είχαν υψηλότερη κυτταροτοξική δράση, ιδίως το γεφιτινίμπη/2-υδροξυ-προπυλιωμένη-β-CyD. Η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συνέπιπτε με αναστολή της φωσφορυλίωσης στην τυροσίνη 1068. Η βελτίωση της διαλυτότητας της γεφιτινίμπης οφείλονταν σε απομάκρυνση από το υδατικό διάλυμα του υδρόφοβου τμήματος του φαρμάκου, καθώς εγκλείεται στην κοιλότητα της CyD. Τα συμπεράσματα της παρούσας μελέτης αποτελούν τη βάση έρευνας για τη χρήση αναστολέων τυροσινικής κινάσης στην αντιμετώπιση του νευροβλαστώματος και τη στροφή σε στοχευμένες θεραπείες με υψηλότερη αποτελεσματικότητα και λιγότερες παρενέργειες.