Φαρμακολογική μελέτη της αντινεοπλασματικής δράσης νέων παραγώγων τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων

Abstract

The fusion of 1,2,4-triazole and 1,3,4-thiadiazole rings generated a category of therapeutic agents with a broad spectrum of pharmacological properties including anticancer. The significant chemical potentialities of 1,2,4-triazoles and 1,3,4-thiadiazoles led to the design and synthesis of new 3,6-disubstituted 1,2,4-triazolo-[3,4-b]-1,3,4-thiadiazoles derivatives some of which stood out for their in vitro and in vivo anticancer activity. The present study aims to the in vitro evaluation of the pharmacological anticancer activity of novel compounds and screening of the most effective, investigation of protein targets and finally in vitro estimation of their impact on the predictive biomarkers, MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) and TMB (tumor mutation burden). Additionally, the apoptotic activity and the effect on cell cycle progression induced by the most effective compound were studied. For the purpose of this study, human cancer cell lines were used: five colorectal (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) and two prostate (DU-145, PC-3) with different MSI phenotypes. The in vitro antineoplastic activity of KA25, KA26, KA39, SF29, and SF30 was assessed according to MTT assay, while the effect of KA39 on apoptosis and cell cycle was determined by staining assays such as annexin V/7-AAD and propidium iodide, respectively. In the context of the antineoplastic activity of the tested compounds, in silico studies were carried out according to which TopIIα and Akt1/2 proteins constitute potential therapeutic targets. In case of TopIIα, the inhibitory effect of KA25, KA26, and KA39 was investigated both on its catalytic activity (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) and its phosphorylation (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). As far as it concerns Akt1/2 kinases, KA25 and KA39 were estimated as potential inhibitors by intracellular flow cytometry. The impact of the most effective derivative, KA39, on the immunogenic predictive biomarkers, PD-L1, MSI και TMB, was studied in MSI-H and MSS cancer cells according to extracellular flow cytometry, PCR analysis conducted in the five microsatellite systems of Bethesda panel and targeted sequencing (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), respectively. According to MTT results, among all the tested triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, KA39 emerged as the most effective due to its significant cytostatic and cytotoxic activity induced in all cancer cell lines (P<0.001). The administration of KA39 in cancer cells induced early and late apoptosis, as well as caused cell cycle arrest at phase S (P<0.001). The KA39-induced formation of supercoiled DNA during the relaxation reaction of plasmid DNA in combination with the statistically significant reduction of TopIIα phosphorylation indicates that KA39 belongs to TopIIα inhibitors. Furthermore, a remarkable inhibition of Akt1/2 phosporylation was impelled upon treatment with KA25 and KA39 (P<0.01). Moreover, the effect of KA39 triggered the overexpression of the immunoregulatory molecule, PD-L1, in MSI-H and MSS cancer cells. Additionally, the MMR mechanism was destabilized, particularly in MSI-H and to a lesser extent in MSS cancer cell lines. Finally, comparing control groups with the cells that received KA39, no alterations were observed in TMB.To conclude, among the new triazolo-[3,4-b]-thiadiazoles derivatives, the chemical compound KA39 was proved as the most effective, according to the in vitro cytostatic and cytotoxic activity induced in all the tested cancer cell lines. The current findings imply that KA39 behaves as a multitarget drug, inducing a remarkable antineoplastic activity as well as triggering the expression of the PD-L1 ligand and provoking simultaneously disorders in the functionality of the MMR mechanism, which are reflected in MSI phenotype. Conclusively, KA39 derivative seems to be a very promising anticancer agent with possibilities for further development in clinical practice and cancer chemo-immunotherapy.

Η σύντηξη του 1,2,4-τριαζολικού δακτυλίου με τον 1,3,4-θειαδιαζολικό δακτύλιο αποτελεί μια κατηγορία θεραπευτικών παραγόντων με ευρύ φάσμα φαρμακολογικών ιδιοτήτων συμπεριλαμβανομένου της αντικαρκινικής. Οι σημαντικές δυνατότητες χημικής σύνθεσης των 1,2,4-τριαζολίων και 1,3,4-θειαδιαζολίων οδήγησαν στο σχεδιασμό και σύνθεση νέων παραγώγων 3,6 διϋποκατεστημένων 1,2,4-τριαζολο-[3,4-b]-1,3,4-θειαδιαζολίων εκ των οποίων κάποια ξεχώρισαν για την in vitro και in vivo αντικαρκινική τους δράση.Σκοπός είναι η in vitro εκτίμηση της φαρμακολογικής αντικαρκινικής δράσης νέων πρωτότυπων ενώσεων και η διαλογή των αποτελεσματικότερων εξ’ αυτών, η διερεύνηση των πρωτεϊνών που αποτελούν στόχους των υπό μελέτη παραγώγων και τέλος η in vitro αξιολόγηση των επιδράσεών τους στους προβλεπτικούς βιοδείκτες MSI (microsatellite instability), PD-L1 (programmed death ligand-1) και TMB (tumor mutation burden). Επίσης, μελετήθηκε η αποπτωτική δράση και η επίδραση των υπό μελέτη μορίων στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου.Για τις ανάγκες της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές: πέντε παχέος εντέρου (DLD-1, HT-29, LoVo, LS174T, SW403) και δύο προστάτη (DU-145, PC-3) με διαφορετικούς MSI φαινοτύπους. Η in vitro αντινεοπλασματική δράση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26, ΚΑ39, SF29 και SF30 μελετήθηκε με τη μέθοδο MTT ενώ με τις μεθόδους χρώσης με αννεξίνη V/7-AAD και ιωδιούχο προπίδιο εκτιμήθηκε η επίδραση του μορίου ΚΑ39 στην απόπτωση και στον κυτταρικό κύκλο, αντίστοιχα. Σχετικά με την αντινεοπλασματική δράση των υπό μελέτη μορίων, διεξήχθησαν in silico υπολογιστικές μελέτες οι οποίες ανέδειξαν τις πρωτεΐνες TopIIα και Akt1/2 ως πιθανούς στόχους. Στην περίπτωση της TopIIα, η ανασταλτική επίδραση των παραγώγων ΚΑ25, ΚΑ26 και ΚΑ39 διερευνήθηκε τόσο στην καταλυτική της δραστηριότητα (plasmid-based topoisomerase II drug screening kit) όσο και στη φωσφορυλίωσή της (Human Phospho-TOP2A/Topoisomerase II Alpha Cell-Based Phosphorylation ELISA Kit). Σχετικά με τις κινάσες Akt1/2, εξετάσθηκαν τα παράγωγα ΚΑ25 και ΚΑ39 ως πιθανοί αναστολείς με τη μέθοδο της ενδοκυττάριας κυτταρομετρίας ροής. Η επίδραση του πλέον δραστικού παραγώγου ΚΑ39 στους ανοσογόνους προβλεπτικούς δείκτες, PD-L1, MSI και TMB, μελετήθηκε σε MSI-H και MSS καρκινικά κύτταρα με τη μέθοδο της εξωκυττάριας κυτταρομετρίας ροής, με PCR ανάλυση για τα πέντε συστήματα μικροδορυφόρων του πάνελ Bethesda και της στοχευμένης αλληλούχισης (Oncomine™ Tumor Mutation Load Assay), αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των MTT πειραμάτων, από τα υπό μελέτη παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, ως πιο δραστικό ανεδείχθη το χημικό μόριο ΚΑ39 λόγω της αξιοσημείωτης κυτταροστατικής και κυτταροτοξικής δράσης που προκάλεσε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές (P<0.001). Η χορήγηση του παραγώγου ΚΑ39 οδήγησε τα καρκινικά κύτταρα σε πρώιμη και όψιμη απόπτωση και προκάλεσε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση S (P<0.001). Ο επαγόμενος από το παράγωγο ΚΑ39 σχηματισμός του υπερελικωμένου DNA κατά την αντίδραση χαλάρωσης του πλασμιδιακού DNA σε συνδυασμό με τη στατιστικά σημαντική μείωση στη φωσφορυλίωση της TopIIα υποδεικνύουν πώς η ΚΑ39 ανήκει στους αναστολείς TopIIα. Ακόμη, παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αναστολή στη φωσφορυλίωση των Akt1/2 ύστερα από την επίδραση των παραγώγων ΚΑ25 και ΚΑ39 (P<0.01). Επιπλέον, η επίδραση του χημικού μορίου ΚΑ39 οδήγησε σε υπερέκφραση του ανοσορρυθμιστικού μορίου PD-L1 στα MSI-H και MSS κύτταρα. Ακόμη, προκάλεσε αποσταθεροποίηση του μηχανισμού MMR κυρίως στις MSI-H και σε μικρότερη έκταση στις MSS κυτταρικές σειρές. Τέλος, συγκρίνοντας τις ομάδες ελέγχου με τα κύτταρα που έλαβαν το παράγωγο ΚΑ39, ουδεμία μεταβολή παρατηρήθηκε στο TMB.Συμπερασματικά, από τα νέα παράγωγα των τριαζολο-[3,4-b]-θειαδιαζολίων, η χημική ένωση ΚΑ39 απεδείχθη η πιο δραστική σύμφωνα με την in vitro κυτταροστατική και κυτταροτοξική δράση που επήγαγε σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα παρόντα επιστημονικά ευρήματα δείχνουν πώς πρόκειται για ένα πιθανό φάρμακο με πολλαπλούς στόχους και σημαντική αντινεοπλασματική δράση καθώς και την ικανότητα να πυροδοτήσει την έκφραση του ανοσοσυνδέτη PD-L1 και συγχρόνως να προκαλέσει διαταραχές στη λειτουργικότητα του μηχανισμού MMR οι οποίες αποτυπώνονται στο φαινότυπο MSI. Συμπερασματικά, το παράγωγο ΚΑ39 φαίνεται να είναι ένας πολλά υποσχόμενος αντικαρκινικός παράγοντας με δυνατότητες περαιτέρω ανάπτυξης στην κλινική εφαρμογή και στην αντικαρκινική χημειο-ανοσοθεραπεία.