Νέοι λακταμικοί στεροειδείς αλκυλιωτές αναστολείς των PARP-1/PARP-2 για τη στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Abstract

The purpose of this dissertation is to investigate the antitumor potential of some innovative and newly synthesized homo-aza-steroid derivatives against ovarian cancer cells. Ovarian cancer is one of the most common causes of death in the female population. Currently, the usual treatment includes surgery and a combination of platinum/ taxane chemotherapy. However, the treatment proves ineffective for a high percentage of patients, due to the emergence of drug resistance in many chemotherapeutic procedures. Therefore, it is critical to develop new therapeutic approaches, capable of bypassing any chemo-resistance, and at the same time optimizing the effectiveness of the treatment, while reducing the drug toxic effects. Inherited mutations in the BRCA1 and BRCA2 genes have been associated with an increased risk of ovarian cancer. These genes are involved in DNA repair, through homologous recombination and double-stranded repair of the genetic material (DNA). PARPs, with an emphasis on the predominant PARP-1 and PARP-2 (approximately 80% of all the functionalitiy), are protein molecules that participate in a variety of biochemical processes and molecular pathways. One of them is a second key repair mechanism, the single-strand DNA repair, which takes place mainly in BRCA-deficient cells, involving the activity of PARP-1/2 enzymes. Cancer cells with such a dysfunction, are an excellent target for pharmaceutical use of PARP enzyme inhibitors, as repair is bypassed and cell death occurs. The methodology of the present research dissertation includes two experimental approaches: The first one concerns the in silico design, the evaluation of the ADMET properties and of the PARP inhibitory potential of the tested compounds through molecular docking, but also the chemical synthesis of the new compounds found efficient/ competent through the above procedures. The second approach is focused on the evaluation of the compounds’ biological activity in vitro and on a molecular level, through MTT, ELISA and PCR, in terms of cytotoxicity, inhibition of PARP and their transcriptional effects respectively. The novel studied molecules take a structure of a hybrid-lactam steroid derivative, conjugated to an alkylator, i.e. toxic molecule that cause DNA damage. The results of this study indicate that they are indeed anti-cancer agents, with specific cytotoxic activity mostly against cancer cells. They present both reduced toxicity and significant inhibitory effect on PARP-1 and PARP-2 proteins, at the same time.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή ερευνάται η αντικαρκινική δράση νεοσυντιθέμενων ομο-αζα-στεροειδικών παραγώγων έναντι καρκινικών κυττάρων ωοθηκών. Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί μία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο για το γυναικείο πληθυσμό. Επί του παρόντος, η συνηθέστερη θεραπεία περιλαμβάνει χειρουργική επέμβαση και συνδυαστική χημειοθεραπεία πλατίνας / ταξανών. Ωστόσο, η θεραπεία αποδεικνύεται αναποτελεσματική για ένα μεγάλο ποσοστό των ασθενών λόγω της εμφάνισης ανθεκτικότητας στα χημειοθεραπευτικά σχήματα. Κατά συνέπεια, κρίνεται απαραίτητη η ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων ικανών να παρακάμπτουν τη χημειο-ανθεκτικότητα και παράλληλα να βελτιστοποιούν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, ελαττώνοντας ταυτόχρονα τις τοξικές δράσεις των φαρμάκων. Κληρονομούμενες μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 έχουν συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου των ωοθηκών. Τα γονίδια αυτά εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, μέσω του ομόλογου ανασυνδυασμού και της δίκλωνης επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού. Οι PARPs, με έμφαση στην PARP-1 και PARP-2 που κυριαρχούν (80% περίπου όλων των λειτουργιών), αποτελούν πρωτεϊνικά μόρια που εμφανίζονται σε ποικιλία από βιοχημικές διαδικασίες και μοριακά μονοπάτια. Ένα από αυτά, είναι ένας δεύτερος βασικός μηχανισμός επιδιόρθωσης, η επιδιόρθωση μονού κλώνου του DNA, που αναλαμβάνει σε κύτταρα με έλλειψη BRCA λειτουργικότητας και αφορά την ενεργότητα των ενζύμων PARP-1/2. Καρκινικά κύτταρα με τέτοια δυσλειτουργικότητα, αποτελούν εξαιρετικό στόχο για φαρμακευτική χρήση αναστολέων των ενζύμων PARP, αφού παρακάμπτεται η επιδιόρθωση και επέρχεται κυτταρικός θάνατος. Η μεθοδολογία της παρούσας ερευνητικής διατριβής περιλαμβάνει δύο πειραματικές προσεγγίσεις: Η πρώτη αφορά τον in silico σχεδιασμό, την αξιολόγηση των ADMET ιδιοτήτων και της ανασταλτικής προς τις PARP λειτουργίας μέσω μοντελικής μοριακής πρόσδεσης (molecular docking), αλλά και τη σύνθεση όσων νέων αζωτούχων στεροειδών μορίων προκριθούν από τις παραπάνω διαδικασίες, ενώ η δεύτερη επικεντρώνεται στην αξιολόγηση της βιολογικής δραστηριότητας τους in vitro και μοριακά, μέσω μεθόδων MTT, χρωματομετρίας ELISA και PCR ως προς την κυτταροτοξικότητα, την αναστολή της PARP και τις μεταγραφικές τους επιδράσεις αντίστοιχα. Τα νέα μελετούμενα μόρια έχουν δομή υβριδικών- λακταμικών στεροειδών παραγώγων, συζευγμένα με αλκυλιωτές, δηλαδή τοξικά μόρια που προκαλούν βλάβη στο DNA. Από τα αποτελέσματα της μελέτης, αποδεικνύεται ότι αποτελούν αντικαρκινικούς παράγοντες με εξειδικευμένη κυτταροτοξική δράση ενάντια στα καρκινικά κύτταρα, ενώ παράλληλα εμφανίζουν μειωμένη τοξικότητα και σημαντική ανασταλτική δράση προς τις πρωτεΐνες PARP-1 και PARP-2.