Μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός βακτηριακών πεπτιδυλ-προλυλ-ισομερασών

Abstract

Peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases, EC: 5.2.1.8) are ubiquitous folding proteins, present in eukaryotic and prokaryotic cells that catalyze the cis/trans isomerization of peptidyl prolyl bonds of newly synthesized target proteins, in which peptide bonds are thought to be synthesized exclusively in the trans conformation. Based on drug specificity PPIases are divided into three distinct and structurally unrelated subfamilies: the cyclophilins, which bind cyclosporin A, the parvulins, which bind the immunosuppressant juglone and the FKBPs, which bind the FK506. Additionally to the proven isomerase function of the majority of PPIase family members, they also demonstrate chaperone activity which allows them to prevent both newly synthesized polypeptide chains and assembled subunits from aggregating into nonfunctional structures, inducing conformational changes in mature target proteins, altering their structure and intermolecular interactions, thus affecting their activity. The main objective of the present study was to explore the biochemical and molecular function of all members of FKBP family of diazotroph A. vinelandii and model E. coli. Our goal was initially addressed through the analysis of the fully sequenced genome of A. vinelandii and E. coli, which revealed the existence of six and five members of the FKBP family, respectively. Recombinant AvfkbX, AvfkbB, AvfkbA1 and AvfkbA2 of A. vinelandii as well as EcfkpA, EcfkpB, EcfklB, EcslyD and Ectig of E. coli exhibited in vitro PPIase activity with different substrate specificities, whilst all, except AvfkbA1, displayed in vitro chaperone activity. We tested AvfkbA1, AvfkbA2, EcfkpA, EcfklB, EcslyD and Ectig variants, each carrying a single point mutation at the PPIase active site, for enzyme activities and found that PPIase activity in AvfkbA1Y194A, AvfkbA2Y84A, and EcfkpAY225A was reduced, whereas no detectable activity was found for variants EcfklBY181A, EcslyDF132A, EctigF198A and for EcfkpBD119A, being the only one who carries three altered amino acids located in FKBP and in the IF domain, as well. The physiological role of FKBP proteins of E. coli was exploited by examining the growth of strains ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD and Δtig, lacking each FKBP gene, under various conditions. Characterization of FKBP mutants revealed that the absence of FKBP proteins resulted in pleiotropic phenotypes, including increased swarming and swimming motility in addition to enhanced biofilm formation. Complementation with FKBP genes restored the motility and sessility phenotypes while complementation with PPIase-deficient FKBP genes, in most cases, failed to rescue the biofilm phenotype, suggesting the involvement of PPIase activity in this motile collective behavior. Cells overexpressing FKBP genes harbored from swarming and swimming plates exhibited elongated cells who failed to divide normally, unlikely to cells overexpressing PPIase-deficient FKBP genes, indicating that PPIase activity is affecting cell length. Multi-copy suppressor screens demonstrated that the expression of a majority of PPIase encoding genes restored swarming and swimming motility and biofilm formation of E. coli FKBP mutant strains. Moreover, the motility and sessility phenotype of EcfkpB mutant strain was inversed by over-expressing several putative prey proteins, in the presence of which the in vitro catalytic activity of the enzyme was diminished. Overexpression of putative prey proteins of fkpB in slyD mutant strain, under swimming and biofilm conditions, demonstrated that only the EcdnaK, EcmreB, EccheA, EcfliC and EcrpoB might be common targets of fkpB and slyD whilst EcdnaK and EccheA might be most probable to validate the bait-prey model with fkpA. Moreover, we explored the physical interaction of EccarA, a putative prey protein of EcfkpB, with EcfkpB and the physical interaction of AvcarA, with AvfkbA1 and AvfkbA2 through affinity chromatography. Cross-link assay contributed in revealing the transient physical interaction of EcfkpB with EcispH, sharing a mutual operon with EcfkpB and possesing two cis proline residues, P8 and P32. Checking the physical interaction of both mutants EcispHP8A and EcispHP32A with EcfkpB, in order to clarify which proline residue is the target, we discovered that only the P8 residue of EcispH is critical for the formation of a protein complex with EcfkpB.

Οι πεπτίδυλ-πρόλυλ cis/trans ισομεράσες (PPIάσες, EC: 5.2.1.8) αποτελούν μια υπεροικογένεια συντηρημένων πρωτεϊνών, οι οποίες απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς, ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς. Καταλύουν την cis/trans ισομερίωση πεπτίδυλ-πρόλυλ δεσμών τόσο νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών όσο και ώριμων πρωτεϊνών στόχων, τροποποιώντας τη δομή τους ή τις ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις τους και ως εκ τούτου επηρεάζουν τη λειτουργία τους. Τα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών διακρίνονται στις εξής οικογένειες: τις κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το FK506 (FKBPs) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι PPIάσες, εκτός από την ενεργότητα PPIάσης, εμφανίζουν και ενεργότητα τσαπερόνης μέσω της οποίας επιτελείται η αναδίπλωση πρωτεϊνών και παρεμποδίζεται η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μελών της FKBP οικογένειας των μικροοργανισμών Azotobacter vinelandii και Escherichia coli. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση του πλήρως αλληλουχημένου γονιδιώματος των δυο βακτηρίων μέσω της οποίας εντοπίστηκαν έξι και πέντε γονίδια αντίστοιχα, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ανήκουν στην FKBP οικογένεια. Κατά τον in vitro υπολογισμό της ενζυμικής ενεργότητας διαπιστώθηκε ότι οι AvfkbX, AvfkbB, AvfkbA1, AvfkbA2 του A. vinelandii και οι EcfkpA, EcfkpB, EcfklB, EcslyD, Ectig του E. coli είναι ενεργές PPIάσες, ενώ οι περισσότερες με βάση τη μέθοδο παρεμπόδισης της δημιουργίας συσσωματωμάτων της συνθάσης του κιτρικού οξέος εμφάνισαν ενεργότητα τσαπερόνης. Στη συνέχεια κατασκευάστηκαν κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων τα οποία μετέχουν στον ενεργό κέντρο PPIάσης κάθε FKBP πρωτεΐνης. Διαπιστώθηκε σημαντική μείωση της ενεργότητας PPIάσης στις AvfkbA1Y194A, AvfkbA2Y84A και EcfkpAY225A ενώ δεν ανιχνεύθηκε ενεργότητα PPIάσης στις EcfklBY181A, EcslyDF132A, EctigF198A και EcfkpBD119A. Ο φυσιολογικός ρόλος των FKBP πρωτεϊνών μελετήθηκε μέσω της ανάπτυξης, σε διαφορετικές συνθήκες, των E. coli στελεχών ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig στα οποία έχει απενεργοποιηθεί το συγκεκριμένο FKBP γονίδιο. Η απουσία των FKBP πρωτεϊνών είχε ως αποτέλεσμα πλειοτροπικούς φαινοτύπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αυξημένη ικανότητα κολυμβητικής και επιφανειακής ομαδικής κίνησης, καθώς και αυξημένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου, συγκριτικά με το στέλεχος αγρίου τύπου. Η έκφραση των αγρίου τύπου γονιδίων EcfkpA, EcfkpB, EcfklB, EcslyD και Ectig στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig επανέφερε τους φυσιολογικούς προαναφερθέντες φαινοτύπους, ενώ η έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων EcfkpAY225A, EcfkpBD119A, EcfklBY181A, EcslyDF132A και EctigF198A στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη δεν επανέφερε, στις περισσότερες περιπτώσεις, το φαινότυπο του σχηματισμού βιοϋμενίου, υποδηλώνοντας τη συμμετοχή των FKBP πρωτεϊνών σε αυτό το οργανωμένο σύστημα ζωής. Εξετάζοντας την κυτταρική μορφολογία των στελεχών που υπερεκφράζουν κάθε FKBP γονίδιο παρατηρήθηκε μια σημαντική κυτταρική επιμήκυνση, αντίθετα με τα στελέχη τα οποία υπερεκφράζουν κάθε μεταλλαγμένο FKBP γονίδιο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργότητα PPIάσης επηρεάζει το μήκος των κυττάρων του E. coli. Επίσης, ο φαινότυπος των στελεχών ΔfkpA, ΔfkpB, ΔfklB, ΔslyD και Δtig επανήλθε στα φυσιολογικά επίπεδα μέσω υπερέκφρασης της πλειοψηφίας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις PPIάσες του E. coli, υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατή μια λειτουργική υποκατάσταση ανάμεσα στα μέλη της υπεροικογένειας των PPIασών. Η αυξημένη ικανότητα ομαδικής, κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου του στελέχους ΔfkpB επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από την υπερέκφραση πρωτεϊνών που αποτελούν πιθανούς στόχους της EcfkpB, υποδηλώνοντας ότι ο παρατηρούμενος φαινότυπος προκύπτει από την λανθασμένη αναδίπλωση των πρωτεϊνών στόχων, λόγω της απουσίας του EcfkpB γονιδίου. Η παρουσία αυτών των πιθανών στόχων είχε ως συνέπεια τη μείωση της in vitro ενεργότητας PPIάσης της EcfkpB. Η υπερέκφραση των πιθανών πρωτεΐνών στόχων της EcfkpB στο στέλεχος ΔslyD σε συνθήκες κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου έδειξε ότι οι πρωτεΐνες EcdnaK, EcmreB, EccheA, EcfliC και EcrpoB είναι πιθανοί κοινοί στόχοι της EcfkpB και της EcslyD ενώ μόνο οι EcdnaK και EccheA είναι πιθανοί κοινοί στόχοι της EcfkpB και της EcfkpA. Τέλος, ανιχνεύθηκε η αλληλεπίδραση της EccarA, η οποία αποτελεί πιθανή πρωτεΐνη στόχο της EcfkpB, με την EcfkpB και η αλληλεπίδραση της AvcarA, με τις AvfkbA1 και AvfkbA2 μέσω συνέκφρασης και απομόνωσης των σταθερών συμπλεγμάτων. Η χρήση του διασυνδετή DTBP συνέβαλλε στη σταθεροποίηση του συμπλέγματος της EcfkpB με την EcispH, η οποία αποτελεί πιθανή πρωτεΐνη στόχο της EcfkpB. Η EcispH εδράζεται στο ίδιο οπερόνιο με την EcfkpB και διαθέτει δύο κατάλοιπα προλίνης με cis διάταξη, τα P8 και P32. Η εξέταση της αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμένων ως προς την προλίνη EcispHP8A και EcispHP32A με την EcfkpB κατέδειξε ότι μόνο η προλίνη P8 είναι υπεύθυνη για το σύμπλεγμα αυτό.