Μελέτη παραγόντων που επηρεάζουν τη μικροσπορογένεση στη τομάτα θερμοκηπίου (Lycopersicon esculentum Mill.)

Abstract

The ultimate aim of this study, was to investigate the effects of climatic factors (especially extreme temperatures and the level of solar radiation), on the seasonal production and viability of tomato pollen throughout the cultivation period (October-July) within the greenhouse, which is in turn closely correlated with the productivity of the tomato crop, particularly under adverse climatic conditions. The estimation of pollen viability was based on in vitro germination on semi-solid (with agar) substrates. Because of the lack of a standard semi-solid medium for the in vitro germination of tomato pollen, an attempt was made to define the effects of several physical (incubation temperature, pH of the medium) and chemical factors on the in vitro germinability of tomato pollen on semi-solid, agar-based media. The addition of various chemical compounds (plant growth regulators, amino acids, vitamins, flavonoids) did not prove essential for tomato pollen germination. However, partial substitution of sucrose by PEG-6000 (but not by mannitol), as well as the inclusion of the flavonoids quercetin and myricetin (at 5 mg 1⁻¹) within the medium, significantly increased the germinability of tomato pollen, which was also favoured by an incubation temperature of 15°C and medium pH of 6.5. In addition, the type and purity of the gelling agent used in semi-solid substrates, significantly affected the in vitro germinability and tube length of tomato pollen on semi-solid media. Although gelling agents of high purity (e.g. washed agar or agarose) did not satisfactorily supply germinating tomato pollen with the essential ions K, Mg and Ca, gelling agents of a higher inherent ion content reduced pollen germination, possibly because of the presence of germination inhibitors. Washing low purity agars with distilled water increased their efficacy, by removing part of their ion content. Since Ca concentrations higher than 3mM in the semi-solid medium impair tomato pollen germination, the effectiveness of the addition of K, Mg and Ca according to Brewbaker and Kwack (1963) - which is recommended for use in liquid media - depends on the inherent Ca content of the agar. The experimental data presented show that a low concentration of Ca (0,15mM) within the semi-solid media is adequate for tomato pollen germination, although ImM Ca is optimal. Although this low Ca demand for tomato pollen germination is easily covered by the inherent Ca content of the agar, this is not the case for K and Mg, since in most cases there is a need for the external addition of K and Mg, especially when high purity agars are employed. Studies on the in vitro germination physiology of tomato pollen showed that the respiratory activity during incubation in liquid media depends on the tomato pollen viability and the incubation temperature. Tomato pollen respiration and germination proved to be susceptible to high temperatures (30° or 35°C), at which, the rate of respiration decreases significantly with time, following a reduction of pollen germinability and pollen tube growth. In addition, the experimental data show that the final rate of respiration after 6-7 hours of incubation may serve as an reliable indicator of pollen viability (which is estimated by pollen germinability x tube growth), in contrast to the initial rate of respiration and the CO₂ produced, over the 7 hour incubation period. Respiratory substrates such as succinate and NADH, respiratory uncouplers and ADP penetrated the intact tomato pollen grain and affected respiration, in a way that is not dependent on the rate of respiration. Studies of the reduction of the rate of respiration observed under a moderately high incubation temperature (30°C), revealed that although at the initial and middle stages of germination (after I and 4 hours of incubation) the addition of respiratory substrates strongly increased the rate of respiration indicating a lack of endogenous oxidisable substrates, after 7 hours of incubation substrate addition had less effect, indicating that the mitochondria at this stage present a diminished capacity for inoxidation of exogenously applied respiratory substrates. According to the results of this study, adverse climatic conditions negatively affect microsporogenesis and subsequently the fruit-set of tomato plants, primarily by the impairment of pollen productivity by the plants, rather than a lower viability of the pollen grains. Under low (<10°C) or high (>32°C) temperatures, initially a reduction of pollen production per flower is observed, whereas pollen viability is reduced only after acute (temperatures lower than 7°C of higher than 38°C) or prolonged stress by extreme temperatures, especially in combination with low solar radiation. In particular, this study emphasizes the major role of solar radiation on the seasonal productivity of pollen, when temperature is not a limiting factor for microsporogenesis. By contrast, pollen viability did not exhibit such a relationship with radiation. Since inadequate radiation negatively affects microsporogenesis, even when the temperature regime within the greenhouse is optimal, adequate radiation has proved to be a necessary prerequisite for satisfactory production of viable pollen. On the other hand, high levels of solar radiation decrease the negative consequences of low temperatures on pollen production, suggesting an influence of the carbohydrates reserves of the plants on microsporogenesis, under unfavourable climatic conditions. Data derived from artificial pollinations at various seasons, showed that the correlation between pollen viability and its capacity to produce seeds is affected by climatic factors, as well as by the susceptibility of the genotype to set fruits under adverse climatic conditions. The female parts of the flowers are also implicated, possibly due to the supply of nutrients from stylar tissues to the growing pollen tube, and/or due to the viability of the ovules.

Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση των κλιματικών συνθηκών (με έμφαση στις ακραίες θερμοκρασίες και στα επίπεδα του φωτισμού), στην εποχιακή διακύμανση της παραγωγικότητας σε γύρη των φυτών τομάτας και της βιωσιμότητας της γύρης, καθ' όλη την περίοδο καλλιέργειας στο θερμοκήπιο (Οκτώβριος-Ιούλιος), γεγονός που σχετίζεται στενά με την παραγωγικότητα της καλλιέργειας, ιδιαίτερα υπό δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Η εκτίμηση της βιωσιμότητας της γύρης πραγματοποιήθηκε μέσω της in vitro βλάστησής της σε ημιστερεά (με άγαρ) τεχνητά μέσα βλάστησης. Εξαιτίας της έλλειψης πρότασης μέσου συγκεκριμένης σύστασης (standard medium) για τα ημιστερεά μέσα in vitro βλάστησης της γύρης της τομάτας, αρχικά διερευνήθηκε η επίδραση διαφόρων φυσικών (θερμοκρασία επώασης, pH υποστρώματος) και χημικών παραγόντων στην in vitro βλάστηση της γύρης δύο γονότυπων τομάτας σε ημιστερεά μέσα με άγαρ. Η εξωγενής προσθήκη διαφόρων χημικών στοιχείων (ρυθμιστές ανάπτυξης, αμινοξέα, βιταμίνες, φλαβονοειδή), έδειξε ότι η παρουσία τους δεν είναι απαραίτητη. Όμως, η μερική αντικατάσταση της σακχαρόζης από PEG-6000 (αλλά όχι από μαννιτόλη), καθώς και η προσθήκη των φλαβονοειδών quercetin και myricetin (σε συγκέντρωση 5 mg 1⁻¹) επέδρασαν θετικά στην βλαστικότητα της γύρης, η οποία επίσης ευνοήθηκε σε θερμοκρασία επώασης 15°C και μέσο με pH 6.5. Αποδείχθηκε περαιτέρω ότι, η in vitro βλάστηση της γύρης της τομάτας σε ημιστερεά υποστρώματα επηρεάζεται σημαντικά από το είδος και την καθαρότητα του μέσου ζελατινοποίησης που χρησιμοποιείται, με τα "καθαρότερα" μέσα (π.χ. άγαρ υψηλής καθαρότητας, αγαρόζη) να μην υποστηρίζουν ικανοποιητικά τις ανάγκες της γύρης της τομάτας σε ιόντα Κ, Mg και Ca για βλάστηση. Όμως, μέσα χαμηλότερης καθαρότητας αν και ενδεχομένως παρέχουν σε ικανοποιητικά επίπεδα τα απαραίτητα για βλάστηση ιόντα Κ, Mg και Ca, επηρεάζουν αρνητικά τη βλάστηση, πιθανά λόγω της παρουσίας στις προσμείξεις τους παρεμποδιστικών στοιχείων, γιατί η "έκπλυσή" τους με απεσταγμένο νερό βελτίωσε την αποτελεσματικότητά τους, απομακρύνοντας μέρος των προσμείξεων. Λόγω της αρνητικής επίδρασης στη βλάστηση της γύρης της τομάτας συγκεντρώσεων Ca στα μέσα βλάστησης άνω των 3mM, στα ημιστερεά μέσα εμφανίστηκε εξάρτηση της αποτελεσματικότητας της προσθήκης Κ, Mg και Ca κατά Brewbaker and Kwack (1963) που ενδείκνυται στα τεχνητά υγρά μέσα βλάστησης της γύρης πολλών φυτικών ειδών, από το ενδογενές περιεχόμενο των άγαρ σε Ca. Αντίστοιχα, αποδείχθηκε ότι οι απαιτήσεις της γύρης της τομάτας σε Ca για την in vitro βλάστησή της δεν είναι υψηλές (0,15mM Ca στα μέσα επαρκούν για ικανοποιητική βλάστηση, όταν η άριστη συγκέντρωση ανέρχεται σε ImM Ca) και καλύπτονται στις πλείστες των περιπτώσεων από το ενδογενές περιεχόμενο σε Ca των άγαρ, σε αντίθεση με τα Κ και Mg, που απαιτείται η εξωγενής προσθήκη τους, ιδίως όταν χρησιμοποιούνται μέσα ζελατινοποίησης υψηλής καθαρότητας. Η διερεύνηση της φυσιολογίας της in vitro βλάστησης της γύρης της τομάτας έδειξε ότι, η πορεία της αναπνευστικής δραστηριότητας της γύρης κατά την in vitro βλάστηση, καθορίζεται από τη ζωτικότητά της και τη θερμοκρασία επώασης. Η γύρη της τομάτας εμφανίζεται σχετικά θερμοευαίσθητη, με το ρυθμό αναπνοής να κάμπτεται έντονα με την πάροδο του χρόνου επώασης στις υψηλές θερμοκρασίες (30° και 35°C), που επίσης επηρέασαν αρνητικά τη βλαστικότητα των γυρεόκοκκων και την ανάπτυξη των γυρεοσωλήνων. Περαιτέρω, αποδείχθηκε ότι ο ρυθμός αναπνευστικής δραστηριότητας μετά 6-7 ώρες in vitro επώασης, μπορεί να αποτελεί αξιόπιστο κριτήριο για τη ζωτικότητα της γύρης της τομάτας, σε αντίθεση με τον αρχικό ρυθμό αναπνοής, καθώς και τη συνολική παραγωγή CO₂ μετά 7 ώρες επώασης. Η γύρη της τομάτας επέδειξε περατότητα και αντίδραση στην εξωγενή παροχή αναπνευστικών υποστρωμάτων, αποδεσμευτών της φωσφορυλίωσης και ADP, με την ένταση της αντίδρασης να μην εξαρτάται από το ρυθμό της αναπνευστικής δραστηριότητας. Η διερεύνηση των αιτίων που οδηγούν στην κάμψη της αναπνευστικής δραστηριότητας της γύρης σε μέτρια υψηλές θερμοκρασίες (30°C), μέσω της αντίδρασης του αναπνευστικού μηχανισμού σε διάφορα στάδια της in vitro βλάστησης της γύρης, στην εξωγενή παροχή αναπνευστικών υποστρωμάτων, αποδεσμευτών της φωσφορυλίωσης και ADP, έδειξε ότι ενώ στα αρχικά και ενδιάμεσα στάδια της βλάστησης (1 και 4 ώρες επώασης) παρατηρείται έντονα θετική επίδραση των αναπνευστικών υποστρωμάτων στο ρυθμό αναπνευστικής δραστηριότητας λόγω πιθανής εξάντλησης των ενδοκυτταρικών αποθεμάτων, μετά από 7 ώρες βλάστησης εμφανίζεται μείωση της αντίδρασης αυτής, υποδηλώνοντας ίσως την απώλεια της ικανότητας των μιτοχονδρίων να οξειδώνουν τα εξωγενώς παρεχόμενα αναπνευστικά υποστρώματα. Τα πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν πως η επίδραση των κλιματικών παραγόντων στη μικροσπορογένεση και κατ’ επέκταση στην καρπόδεση της τομάτας, είναι εντονότερη στην παραγωγικότητα των φυτών σε γύρη, παρά στη βιωσιμότητα της παραγόμενης γύρης. Υπό χαμηλές (<10°C) ή υψηλές (>32°C) θερμοκρασίες παρατηρείται αρχικά μείωση της παραγωγής γύρης ανά άνθος, ενώ η βιωσιμότητα περιορίζεται μόνο μετά από οξεία (λόγω ακραία χαμηλών <7°C ή υψηλών >38°C θερμοκρασιών) ή παρατεταμένη καταπόνηση λόγω μη ευνοϊκών θερμοκρασιών, καθώς και σε συνδυασμό τους με χαμηλό φωτισμό. Αντίστοιχα, η παρούσα μελέτη ανέδειξε το φωτισμό σε κυρίαρχο παράγοντα για την εποχιακή διακύμανση της παραγωγικότητας των φυτών σε γύρη, τουλάχιστον όταν η θερμοκρασία δεν αποτελεί περιοριστικό παράγοντα για τη μικροσπορογένεση, ενώ η βιωσιμότητα της γύρης δεν επέδειξε αντίστοιχη εξάρτηση από τα επίπεδα φωτισμού. Τα επαρκή επίπεδα φωτισμού αποτελούν απαραίτητη προϋπόθεση για την ικανοποιητική παραγωγή βιώσιμης γύρης, αφού ο ανεπαρκής φωτισμός επιδρά αρνητικά στη μικροσπορογένεση ακόμα και όταν οι θερμοκρασίες εντός του θερμοκηπίου κυμαίνονται σε άριστα επίπεδα. Αντίθετα, υψηλά επίπεδα φωτισμού αμβλύνουν τις αρνητικές επιδράσεις των χαμηλών θερμοκρασιών στην παραγωγικότητα των φυτών σε γύρη, υποδηλώνοντας εμπλοκή των αποθεμάτων των φυτών σε υδατάνθρακες στη μικροσπορογένεση υπό δυσμενείς κλιματικές συνθήκες. Δεδομένα από ελεγχόμενες επικονιάσεις σε διαφορετικές εποχές καλλιέργειας, έδειξαν ότι η σχέση της βιωσιμότητας της γύρης και της σποροπαραγωγικής της ικανότητας επηρεάζεται τόσο από τις κλιματικές συνθήκες, όσο και από την ευαισθησία του γονότυπου στην καρπόδεση υπό μη ευνοϊκές συνθήκες, με εμπλοκή και των θηλυκών μερών του άνθους, ενδεχομένως είτε ως προς την τροφοδοσία του αναπτυσσόμενου γυρεοσωλήνα από το στύλο, είτε/και ως προς τη βιωσιμότητα των ωαρίων.