Χαρακτηρισμός βιολογικών δράσεων ενεργών συστατικών αιθέριων ελαίων

Abstract

Aromatic plants have been used since antiquity for their diverse properties, which are mainly attributed to essential oils that are formed as secondary metabolites and have protective roles. Today, essential oils are studied for their biological properties, including their chemopreventive potential, mainly meaning a combination of activities like antioxidant, anti-inflammatory and pro-apoptotic for cancer prevention. The present thesis aimed at screening a large collection of plant extracts of Greek origin for their potential chemopreventive capacity and further explore the molecular modes of action of the most promising ones. For the screening process, fifty plant extracts including essential oils were initially tested for their antioxidant capacity in vitro (DPPH and ABTS assays). Essential oils were tested for their antiproliferative activity against a panel of human cancer cell lines (Caco2, HepG2, MCF-7) using the SRB assay and their chemical composition was also determined. The majority of the oils had terpenes and terpenoids as main components and the oils from Pistacia lentiscus var. Chia (mastic oil, MO), Lippia citriodora (lemon verbena oil, LVO), Origanum dittany and Satureja thymbra stood out for displaying promising biological properties, but only mastic and lemon verbena oils and their major components were chosen for further study. α-Pinene and myrcene, the major components of MO were weak radical scavengers in vitro, while LVO exhibited higher antioxidant activity than its major component, citral. With the exception of myrcene, all phytochemicals exhibited significant antiproliferative activity in vitro, likely attributed to their DNA damaging effect, while both oils presented tumor suppressive capacity in vivo, too. Next, using flow cytometry, it was shown that the oils and their major components induce a G2/M arrest in different human colon cancer cell lines, followed by a concomitant change in the expression levels of cell cycle-related genes in the case of LVO and citral (cyclinA, B1, D, E, p53, p21, survivin). Furthermore, the oils and citral (at the range of concentrations and time points used) caused caspase-independent cell death in Caco2 cells, as lack of increase in pro-apoptotic cell population and caspase-3 enzymatic activity was observed. In addition, no significant alterations were detected in the levels of apoptosis-related proteins apart from cleaved Caspase-3, cIAP-2, Livin, catalase, p21, p27 and TRAIL R1 and R2 for MO and survivin, claspin, TRAILR2, clusterin, HSP60 and Fas for LVO, which together with citral may induce autophagy based on experimental evidence. Finally, it was shown that LVO possesses higher capacity than citral at potentiating the activity of the conventional chemotherapeutic agents oxaliplatin and irinotecan in Caco2 and HT-29 cells. In conclusion, our findings suggest that plant extracts of Greek origin, and especially mastic and lemon verbena oils, possess promising bioactivities that are worthy of further investigation for their future use as chemopreventive and chemotherapeutic agents.

Τα αρωματικά φυτά είναι γνωστά για τις ποικίλες ιδιότητές τους από την αρχαιότητα ένα μεγάλο μέρος των οποίων οφείλεται στα αιθέρια έλαια που αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες. Σήμερα, τα αιθέρια ελαία μελετώνται για τις βιολογικές τους ιδιότητες, ανάμεσα στις οποίες συγκαταλέγεται η χημειοπροληπτική τους δράση, δηλαδή ένας συνδυασμός ενδοκυτταρικών μηχανισμών δράσης συμπεριλαμβανομένων της αντιοξειδωτικής, αντιφλεγμονώδους και προ-αποπτωτικής. Στόχος της έρευνάς μας ήταν να ελέγξουμε έναν αριθμό φυσικών εκχυλισμάτων από ελληνικά φυτά για την πιθανή χημειοπροληπτική τους δράση και να μελετήσουμε περαιτέρω τα πιο υποσχόμενα για τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης τους. Πενήντα φυτικά εκχυλίσματα ελέγχθηκαν για την ικανότητα τους να απενεργοποιούν ελεύθερες ρίζες in vitro (τεχνικές DPPH και ABTS). Παράλληλα, 10 αιθέρια έλαια ελέγχθηκαν για την αντιπολλαπλασιαστική τους δράση εναντίον διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών σειρών in vitro (Caco2, HepG2, MCF-7) (τεχνική SRB) και αναλύθηκε η χημική τους σύσταση. Τα περισσότερα αιθέρια έλαια είχαν ως κύρια συστατικά τερπένια και τερπενοειδή, ενώ συνολικά την σημαντικότερη δράση επέδειξαν τα έλαια των φυτών Satureja thymbra, Origanum dittany Lippia citriodora (λουίζα) και Pistacia lentiscus var. Chia (μαστίχα). Μετά το τέλος της σάρωσης επιλέξαμε τα δύο τελευταία, καθώς και τα κυριότερα συστατικά τους για περαιτέρω μελέτες. Τα δύο κυριότερα συστατικά του μαστιχέλαιου, α-πινένιο και μυρκένιο, δεν παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, ενώ το έλαιο της λουίζας, παρουσίασε ισχυρότερη δράση από το κύριο συστατικό του, citral. Με εξαίρεση το μυρκένιο, όλοι οι παράγοντες εμφάνισαν υψηλή αντιπολλαπλασιαστική ικανότητα in vitro, η οποία συνδέεται με την ικανότητά τους να προκαλούν βλάβες στο DNA, ενώ τα δύο έλαια επέδειξαν και σημαντική ογκοκατασταλτική δράση in vivo. Χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής παρατηρήθηκε αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2/M σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, με παράλληλη αλλαγή στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο (cyclinA, B1, D, E, p53, p21, survivin) για τη λουίζα και το citral. Επίσης, παρατηρήσαμε πως κανένα φυτοχημικό δεν επάγει την κλασσική απόκριση της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου (για τις δεδομένες χρονικές επωάσεις και συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν), καθώς δεν ανιχνεύσαμε ούτε αύξηση του πληθυσμού των προ-αποπτωτικών κυττάρων, ούτε και αύξηση της ενεργότητας του ενζύμου κασπάση-3. Παράλληλα, δεν προκλήθηκε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση εκτός από τις ακόλουθες πρωτεΐνες: ενεργή κασπάση-3, cIAP-2, Livin, catalase, p21, p27 και TRAIL R1 και R2 για το έλαιο της μαστίχας και τις survivin, claspin, TRAILR2, clusterin, HSP60 και Fas για το έλαιο της λουίζας, που μαζί με το citral πιθανόν να ενεργοποιούν το μονοπάτι της αυτοφαγίας βάσει πειραματικών ενδείξεων. Τέλος, η λουίζα διαθέτει μεγαλύτερη ικανότητα ενίσχυσης της δράσης των δύο χημειοθεραπευτικών παραγόντων oxaliplatin και irinotecan στις κυτταρικές σειρές Caco2 και HT-29 σε σχέση με το citral. Συμπερασματικά, τα ευρήματα μας υποδεικνύουν πως τα φυσικά εκχυλίσματα που μελετήσαμε, και κυρίως τα έλαια μαστίχας και λουίζας, διαθέτουν πολλά υποσχόμενες δραστικότητες που αξίζουν περαιτέρω διερεύνησης για τη μελλοντική χρήση τους ως χημειοπροληπτικοί και χημειοθεραπευτικοί παράγοντες.