Mελέτη της ενεργοποίησης του κυτταρικού μονοπατιού PI3K/Akt στο λέμφωμα μανδύα

Abstract

Aberrant activation of phosphoinositide-3 kinase/Akt (PI3K/Akt) and mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling are implicated in the pathogenesis of mantle cell lymphoma (MCL). In this study, 35 tissue samples from primary MCL cases and 2 MCL cell lines (Granta-519 and Rec-1) were used to investigate the PI3K/Akt signaling pathway. The aims of the study were: a) Το study the activation of kinase Akt (Ser473pAkt) using Western blot and immunohistochemistry, b) Το investigate the Western blot and immunohistochemical expresstion levels of phosphatase PTEN, which is a known inhibitor of PI3K/Akt signaling pathway, c) To determine gene copy number of PIK3CA, which encodes for the p110α catalytic subunit of PI3K, using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH), d) To measure PIK3CA transcription levels using quantitative real-time reverse transcription-PCR, e) To investigate somatic mutations of PIK3CA within exons 9 and 20 using PCR-Sequencing, f) To investigate the immunohistochemical expression of Ser2448pmTOR [indicative of mTOR complex 1 (mTORC1) activation status], g) To investigate the immunohistochemical expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), hypoxia-inducible factor 2 alpha (HIF-2α), as well as of the cell cycle regulators p53, p21 and p27, h) To investigate apoptosis using the Tunel assay and immunohistochemistry. More specifically, the Tunel method was used to check for apoptotic cells and additionally immunohistochemistry was applied to investigate the expression of the proteins caspase 3 and survivin, which are both related to apoptosis. Finally, flow cytometry was used to assess apoptosis after treatment of Granta-519 and Rec-1cell lines with LY294002, an inhibitor of PI3K.Thirty six percent of MCL cases and also the 2 MCL lines had Ser473pAkt expression. PTEN protein expression was present in all 14 MCL cases and the 2 MCL cell lines that were analyzed by Western blotting. Five of 33 (15%) cases tested by immunohistochemistry had loss of PTEN expression. Fifteen of 22 (68%) MCL cases and the 2 MCL cell lines harbored a gain (≥3) of PIK3CA gene copy number. In addition, cases with increased PIK3CA gene copy number had elevated PIK3CA mRNA levels. Somatic mutations of PIK3CA gene were not detected. Τhe status of Akt phosphorylation correlated with PIK3CA gene amplification in 7 of 12 (58%) MCL cases and with the loss of PTEN expression in 5 of 12 (42%) MCL cases. Ιmmunohistochemical expression of Ser2448pmTOR, HIF-1α, HIF-2α, p53, p21 and p27 was detected in 61,7%, 73,5%, 23,5%, 18,2%, 0% and 100% of cases respectively. Seventy two percent of patients who expressed HIF-1α had also Ser2448pmTOR expression (p=0.041). In addition, HIF-1α expression correlated to an elevated (≥30%) Ki-67 (p=0.031) and high HIF-1α expression correlated to blastoid variant of disease (p=0.017). Apoptotic cells were rarely found (<1% of the lymphoma cells) in the MCL cases that were analyzed by the Tunel assay. Ιmmunohistochemical expression of caspase 3 and survivin was detected in all cases (100%) that were examined. Finally, inhibition of PI3K by treatment of MCL lines with LY294002 induced increased apoptosis after 24h and 48h.In conclusion, this study describes the following innovations: a) Amplification of the PIK3CA gene is a frequent genetic alteration in MCL. This finding comprises the first report of gain of PIK3CA copy number in hematologic malignancies, b) PIK3CA gene amplification contributes to the oncogenic activation of the PI3K/Akt signalling pathway in MCL. In addition, PIK3CA gene amplification and PTEN protein expression loss are almost mutually exclusive mechanisms of Akt activation in MCL. These data raise the possibility that PIK3CA can be used as a molecular target in MCL, c) There is a common expression of HIF-alphas, especially HIF-1α in MCL patients , d) An overall activation of mTORC1→HIF-1α axis in MCL is suggested, which possibly contributes to the pathogenesis of the disease. Furthermore, a potential role of Ser2448pmTOR in the regulation of HIF-1α is implied. This is the first report which describes an activated mTORC1→HIF-1α axis in lymphomas, e) HIF-1α expression in MCL patients correlates to the adverse prognostic markers blastoid variant and elevated ( ≥30%) Ki-67 and therefore appears to be associated with more aggressive disease. Τhe approach that was followed in this research led to a thorough study of PI3K/Akt signalling pathway in MCL and contributed to the comprehension of the pathophysiology, which is necessary in order to achieve more efficient control of the disease in the future.

H ενεργοποίηση του κυτταρικού μονοπατιού μεταγωγής σημάτων PI3K/Akt, καθώς και του σχετιζόμενου με αυτό μοριακού δικτύου της κινάσης mTOR εμπλέκονται στην παθογένεση του λεμφώματος από κύτταρο μανδύα (ΛΜ – Μantle cell lymphoma – MCL). Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε το κυτταρικό μονοπάτι PI3K/Akt σε ιστικά δείγματα από 35 ασθενείς και επιπλέον σε δύο κυτταρικές σειρές από ΛΜ (Granta-519 και Rec-1). Οι στόχοι ήταν: α) H μελέτη της ενεργοποίησης της κινάσης Αkt (Ser473pAkt) στο ΛΜ, μέσω εφαρμογής Western blot και ανοσοϊστοχημείας β) Η μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης της φωσφατάσης PTEN, γνωστού αναστολέα της οδού PI3K/Akt, με Western blot, καθώς επίσης και με ανοσοϊστοχημεία, γ) Η αναζήτηση με ποσοτική πραγματικού χρόνου (quantitative real-time) PCR (qRT-PCR), καθώς και με φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH), πιθανής ενίσχυσης του γονιδίου PIK3CA, το οποίο κωδικοποιεί για την καταλυτική p110α υπομονάδα της κινάσης PI3K, δ) Η μέτρηση των μεταγραφικών επιπέδων του γονιδίου PIK3CA με ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής PCR (Quantitative real-time reverse transcription PCR), ε) Ο έλεγχος με PCR-Sequencing για παρουσία σωματικών μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA εντός των εξονίων 9 και 20, όπου απαντάται η πλειοψηφία των γνωστών ενεργοποιητικών μεταλλάξεων του PIK3CA, στ) Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της ενεργοποίησης του συμπλόκου mTORC1 μέσω ελέγχου της φωσφορυλιωμένης κινάσης Ser2448pmTOR, ζ) Η ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης των παραγόντων HIF-1α, HIF-2α και των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου p53, p21 και p27 και η) Η μελέτη της απόπτωσης στο ΛΜ με συνδυασμό Τunel-ανοσοϊστοχημείας. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για παρουσία αποπτωτικών κυττάρων με τη μέθοδο Τunel και επιπλέον ανοσοϊστοχημική διερεύνηση των σχετιζόμενων με την απόπτωση πρωτεϊνών κασπάσης 3 (caspase 3) και survivin. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίπτωση της χορήγησης LY294002, ενός φαρμακευτικού αναστολέα της κινάσης PI3K, στην απόπτωση κυτταρικών σειρών ΛΜ με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής.Τριάντα έξι τοις εκατό των ασθενών, καθώς και οι δύο κυτταρικές σειρές από ΛΜ εμφάνισαν έκφραση της ενεργοποιημένης κινάσης Ser473pAkt. Έκφραση της κινάσης Αkt και της φωσφατάσης PTEN παρατηρήθηκε με Western blot και στις 14 περιπτώσεις που ελέχθησαν, καθώς και στις δύο κυτταρικές σειρές από ΛΜ. Πέντε από τους 33 ασθενείς (15%) δεν εξέφραζαν ανοσοϊστοχημικά την πρωτεΐνη PTEN. Διαπιστώθηκε γονιδιακή ενίσχυση του PIK3CA σε 15 από τους 22 ασθενείς (68%) με ΛΜ, καθώς επίσης και στις δύο κυτταρικές σειρές από ΛΜ που μελετήθηκαν. Eπίσης, οι περιπτώσεις με υψηλό (≥3) αριθμό γονιδιακών αντιγράφων (ενίσχυση) του PIK3CA εμφανίζαν ταυτόχρονα αυξημένα επίπεδα του αντίστοιχου mRNA (p= 0.028). Μεταλλάξεις του γονιδίου PIK3CA εντός των εξονίων 9 και 20 δεν ανευρέθησαν. Σε επτά από τις 12 περιπτώσεις (58%) με έκφραση Ser473pAkt, συνυπήρχε γονιδιακή ενίσχυση (≥3 αντίγραφα) του PIK3CA. Σε πέντε από τις 12 περιπτώσεις (42%) με έκφραση Ser473pAkt διαπιστώθηκε απώλεια της έκφρασης του PTEN αναστολέα. Ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών Ser2448pmTOR, HIF-1α, HIF-2α, p53, p21 και p27 διαπιστώθηκε σε 61,7%, 73,5%, 23,5%, 18,2%, 0% και 100% των περιπτώσεων αντίστοιχα. Δεκαοκτώ από τις 25 περιπτώσεις (72%) με θετικό παράγοντα HIF-1α συνεξέφραζαν Ser2448pmTOR (p=0.041). Ακόμη, η έκφραση του HIF-1α συσχετίσθηκε με υψηλό δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Κi-67 ≥30%) (p=0.031). Επιπλέον, η υψηλού βαθμού έκφραση του HIF-1α συσχετίσθηκε με τη βλαστική μορφή του ΛΜ (p=0.017). Η εφαρμογή της τεχνικής Τunel έδειξε εξαιρετικά σπάνια παρουσία αποπτωτικών κυττάρων (<1% του λεμφωματικού πληθυσμού). Ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών κασπάσης 3 και survivin διαπιστώθηκε στο 100% των περιστατικών που ελέχθησαν. Τέλος, η χορήγηση του φαρμακευτικού αναστολέα της κινάσης PI3K LY294002 στις κυτταρικές σειρές Granta-519 και Rec-1 προκάλεσε επαγωγή της απόπτωσης τόσο στις 24 (24h) όσο και στις 48 ώρες (48h).Από την ανάλυση των ανωτέρω αποτελεσμάτων προκύπτουν τα εξής καινούρια δεδομένα-συμπεράσματα: α) Η ενίσχυση του γονιδίου PIK3CA αποτελεί συχνή γενετική διαταραχή στο ΛΜ. Το εύρημα αυτό έχει επιπρόσθετο ενδιαφέρον, καθώς είναι η πρώτη φορά που αναφέρεται γονιδιακή ενίσχυση του PIK3CA σε κακοήθεια του αιμολεμφικού συστήματος, β) Η ενίσχυση του γονιδίου PIK3CA συμβάλλει στην ογκογόνο ενεργοποίηση του κυτταρικού μονοπατιού PI3K/Akt στο ΛΜ και συμβαίνει κατά κανόνα ανεξάρτητα από την απώλεια της έκφρασης του αναστολέα PTEN. Τα δεδομένα αυτά καθιστούν το PIK3CA ενδιαφέροντα θεραπευτικό στόχο στο ΛΜ, γ) Η έκφραση των παραγόντων HIF-α, ιδιαίτερα του παράγοντα HIF-1α, είναι συνήθης στο ΛΜ, δ) Η έκφραση του παράγοντα HIF-1α στο ΛΜ πιθανόν αντανακλά έναν συνολικά ενεργοποιημένο mTORC1→HIF-1α άξονα, ο οποίος φαίνεται να σχετίζεται με την παθογένεια της νόσου. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της κινάσης mTOR στη θέση της σερίνης 2448 μπορεί να ενέχεται στη ρύθμιση του παράγοντα ΗΙF-1α στο ΛΜ. Η παρουσία ενός ενεργοποιημένου mTORC1→HIF-1α άξονα δεν έχει προηγουμένως περιγραφεί στα λεμφώματα, ε) Η έκφραση του παράγοντα HIF-1α σε ασθενείς με ΛΜ σχετίζεται με δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες [υψηλό ( ≥30%) Ki-67, βλαστική μορφή της νόσου] και επομένως φαίνεται να να συνδυάζεται με πιο επιθετική νόσο. Η προσέγγιση που ακολουθήθηκε στην έρευνα αυτή οδήγησε σε μία ευρεία διερεύνηση του κυτταρικού μονοπατιού PI3K/Akt στο ΛΜ και συνετέλεσε στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας που είναι απαραίτητη προκειμένου να επιτευχθεί μελλοντικά αποτελεσματικότερος έλεγχος της νόσου.