Γενωμική μελέτη και συσχέτιση με την καρκινογένεση, της ομόλογης με την τενσίνη, φωσφατάσης: χρήση νανοϋλικών και μελέτη της ογκοκατασταλτικής της δράσης

Abstract

Phosphatase and tensin homolog protein (PTEN), usually observed with loss of heterozygosity on chromosome 10, is one of the most frequently mutated human tumor suppressor genes. Loss of PTEN activity, either at the protein or genomic level, has been related to many primary and metastatic malignancies including breast cancer. The present study investigates the heterozygosity, mutation spectrum and protein expression of PTEN, PI3K and the three Akt isoforms (Akt1, Akt2 and Akt3) in 43 patients with breast cancer or precursor lesions of the breast and 10 healthy individuals. Microsatellite analysis at the pten locus using D10S215, D10S541 and D10S579 markers indicated that the observed heterozygosity (HO) is lower than the expected heterozygosity (HS) in benign and malignant breast disease. Mutational analysis in exons 1, 5, 7 and 9 of the pten gene revealed several mutations, most of which cause truncation of the PTEN protein and consequently loss of activity. Increased circulating levels of PTEN and phosphorylated PTEN protein were also observed by immunostaining in patients with breast cancer and precursor breast lesions. The respective levels of Akt isoforms varied of the cancer stage.Our data suggest an association between breast cancer and pten mutations, resulting in the production of truncated forms of the corresponding protein, thus indicating that breast carcinogenesis is potentially related to PTEN loss of activity rather than loss of expression. Peripheral blood sampling may provide an advantageous application for the determination of pten gene mutations and its protein expression in human cancer.Several delivery systems are developed to target cancer tissues with limited success due to low protein loading, size control and toxicity. The present study investigates the potentialities of multi walled carbon nanotubes (MWCNTs) as a carrier of the stable unphosphorylated PTEN to breast cancer cells.Cloning, overexpression and isolation of the full length and two truncated forms containing the N-terminal and C-terminal domains, respectively, of recombinant PTEN was achieved from E. coli. We have designed a protein delivery system for the full length PTEN and two truncated forms based on carbon nanotubes. Carbon nanotubes are particularly promising for this area of application due to their high surface area, allowing for high protein loading, their stability under biological conditions, and their unique interaction with cellular membranes. In vitro cell viability was evaluated in breast cancer T-47D cells. Our data indicate that the PTEN immobilization onto functionalized carbon nanotubes has strong efficacy to inhibit cell growth.

Η ομόλογη της τενσίνης, φωσφατάση (PTEN), το γονίδιο της οποίας συνήθως παρουσιάζει έλλειψη ετεροζυγωτίας στο χρωμόσωμα 10, έχει χαρακτηριστεί ως ένα από τα πιο συνήθη ογκοκατασταλτικά γονίδια που εμφανίζουν μεταλλάξεις. Η απώλεια της δραστικότητάς της είτε σε πρωτεϊνικό, είτε σε γονιδιακό επίπεδο έχει συσχετισθεί με ποικίλους πρωτοπαθείς και μεταστατικούς καρκίνους, όπως του μαστού.Η παρούσα διατριβή μελετά την ετεροζυγωτία, τις μεταλλάξεις και την πρωτεϊνική έκφραση της PTEN, της PI3K και των τριών ισομορφών της Akt (Akt1, Akt2 και Akt3) σε 43 άτομα με καρκίνο του μαστού ή πρόδρομων μορφών του καθώς και 10 υγιών ατόμων. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των μικροδορυφορικών περιοχών του γονιδίου pten, χρησιμοποιώντας τους δείκτες D10S215, D10S541 και D10S579, υποδεικνύουν ότι η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία (HO) είναι σε χαμηλότερα επίπεδα από την αντίστοιχη αναμενόμενη (HS) σε καλοήθεις και κακοήθεις παθήσεις του μαστού. Η αλληλούχηση των εξονίων 1, 5, 7 και 9 του γονιδίου pten υπέδειξε μια πληθώρα μεταλλάξεων, οι περισσότερες εκ των οποίων προκαλούν περικομμένες μορφές της πρωτεΐνης με αποτέλεσμα την απώλεια της δραστικότητάς της. Επίσης, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης της PTEN και της φωσφορυλιωμένης της μορφής Ρ-PTEN, μετά από ανίχνευση των πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωση. Τα αντίστοιχα επίπεδα των τριών ισομορφών της Akt ποικίλουν ανάλογα με το στάδιο του καρκίνου. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης προτείνουν πως υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του καρκίνου του μαστού και των μεταλλάξεων του γονιδίου pten, προκαλώντας περικομμένες μορφές της πρωτεΐνης, υποδεικνύοντας με αυτό τον τρόπο ότι η καρκινογένεση του μαστού πιθανώς να συσχετίζεται με την απώλεια της δραστικότητας της PTEN και όχι της έκφρασής της. Συνεπώς, το περιφερικό αίμα μπορεί να αποτελέσει μια αξιόπιστη πηγή για την εύρεση μεταλλάξεων του γονιδίου pten καθώς και της πρωτεϊνικής του έκφρασης στον καρκίνο.Ποικίλα συστήματα μεταφοράς έχουν αναπτυχθεί με στόχο τους καρκινικούς ιστούς, αλλά με περιορισμένη επιτυχία λόγω της μειωμένης δυνατότητας καθήλωσης πρωτεϊνών, ελέγχου του όγκου των εισερχόμενων σωματιδίων και της τοξικότητας που εμφανίζουν. Η παρούσα διατριβή μελετά τις δυνατότητες των πολυφλοιϊκών νανοσωλήνων άνθρακα ως φορείς της φυσιολογικής PTEN σε καρκινικά κύτταρα του μαστού.Η κλωνοποίηση, υπερέκφραση και απομόνωση της ανασυνδυασμένης PTEN καθώς και δύο περικομμένων της μορφών, που αποτελούνται από την αμινοτελική και καρβοξυτελική περιοχή, αντίστοιχα, επετεύχθη σε κύτταρα E. coli. Έπειτα σχεδιάστηκε ένα σύστημα πρωτεϊνικής μεταφοράς της PTEN καθώς και των περικομμένων μορφών της, βασιζόμενο σε νανοσωλήνες άνθρακα (CNTs). Η κατηγορία αυτή των νανοσωλήνων είναι κατάλληλη για τέτοιου είδους εφαρμογές λόγω της δυνατότητάς τους να καθηλώνουν μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης εξαιτίας της μεγάλης επιφάνειάς τους, της σταθερότητας που παρουσιάζουν σε βιολογικά συστήματα και των μοναδικών αλληλεπιδράσεών τους με τις κυτταρικές μεμβράνες. Μετά από αξιολόγηση της κυτταρικής βιωσιμότητας της καρκινικής σειράς T-47D, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν πως η σταθεροποίηση της PTEN σε κατάλληλα τροποποιημένους νανοσωλήνες άνθρακα αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.