Μελέτη μορίων που εμπλέκονται στα μονοπάτια σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR και RAS/RAF/MEK/ERK σε αστροκυτώματα

Abstract

Astrocytomas the most common type of primary brain tumour represent a spectrum of tumours of various differentiation Glioblastomas (GBMs) in particular are notorious for their rapid growth and dismal prognosis despite multidisciplinary therapeutic approaches Dissecting the signal transduction pathways is imperative for the development of more rational biologic treatment strategies allowing the targetting of specific steps in the transduction cascade for therapeutic purposes Two of the most important signalling cascades frequently dysregulated in cancer are the Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK) and the PI3K/AKT/mTOR pathways The Ras/RAF/MEK/ERK intracellular signal transduction pathway is a highly conserved module that is involved in various cellular functions including cell proliferation, differentiation and migration It is activated m response to many different signals andis organized as a cascade in which RAF proteins are activated in a Ras dependent manner Once recruited to the membrane and activated by Ras RAF phosphorylates and activates MEK1/2 which in turn phosphorylates and activates the effector MAP kinases ERK1 and ERK2 Upon activation ERK1/2 can phosphorylate over 100 possible substrates with diverse functions such as membrane cytoplasmic cytoskeletal nbosomal and nuclear proteins (transcription factors) that can influencecell fate The PI3K/AKT/mTOR signalling pathway plays a complex role in cell biology metabolism and in the regulation of cell growth and death Activation of PI3K can occur through tyrosine kinase growth factor receptors such as epidermal growth factor receptor (EGFR) and insulin like growth factor 1 receptor (IGF IR) cell adhesion molecules such as integrins G protein-coupled receptors (GPCRs) and oncogenes such as Ras PI3K phosphorylates PIP2 to PIP3 which activates downstream effector molecules such as AKT AKT functions through its ability to phosphorylate a number of key pro oncogenic targets that promote cell growth or inhibit apoptotic pathways and directly phosphorylates and inhibits TSC1 and TSC2 which in turn activate mTOR and downstream targets mTOR is a central regulator of protein synthesis cell ρ rohferation cell cycle progression and cell survival The mTORCl pathway regulates cell growth through its downstream effectors such as theregulators of translation 4EBP1 and p70S6Kl The current investigation focuses on the presence of mutations in the PIK3CA gene We also examined the expression of pERK ρΑΚΤ ρ mTOR and ρ p70S6K in diffusely infiltrating astrocytomas This is a study of 155 diffusely infiltrating astrocytomas Polymerase chain reaction single strand confirmation polymorphism (PCR SSCP) and sequencing analysis were used for PIK3CA gene mutation detection pERK pAKT p-mTOR and ρ p70S6Kexpression were examined by immunohistochemistry Statistical analysis was performed Mutational analysis identified mutations in exon 9 in two out of 52 cases (3%) of glioblastomas whereas no mutations were found in exon 20 of PIK3CA gene Neither diffuse astrocytomas nor anaplastic astrocytomas revealed any mutations in these exons of PIK3CA gene Nuclear and cytoplasmic ρ ERK immunoreactivity was displayed in 98 8% and 73 3% of cases respectively wher eas nuclear andcytoplasmic ρ AKT immunoreactivity was displayed in 93 05% and 59 7% of cases respectively ρ ERK and ρ AKT nuclear expression was positively correlated with ρ ERK and ρ AKT cytoplasmic expression respectively Moreover nuclear and cytoplasmic ρ ERK expression and ρ AKT cytoplasmic expression were positively correlated with VEGF ρ ERK nuclear expression also correlated with microvascular characteristics ρ mTOR expression was mainly cytoplasmic and was observed in 84 6% of cases whereas ρ p70S6K expression was mainly nuclear and was observed in all of cases pmTOR cytoplasmic expression was positively correlated with p-p70S6K nuclear expression Moreover ρ mTOR expression increased in parallel with tumour grade whereas ρ p70S6K expression was marginaly correlated with patients age Multivariate analysis selected ρ ERK nuclear and p-AKT cytoplasmic expression as significant prognosticators of patients survival Our study reports the low frequency of PIK3CA mutations in astrocytomas despite the presence of activated AKT proteins Moreover the correlation of ρ ERK ρ AKT ρ mTOR and p-p70S6K expression with patients survival and standard chmcopathological features suggests the possible crucial role of the activation ofthese proteins in human ghomagenesis In conclusion PI3K/AKT/mTOR and RAS/RAF/MERK/ERK pathways cooperate to promote ghomagenesis and encourage prospective investigations to validate their role as therapeutic targets.

Τα αστροκυτώματα, που αποτελούν τον πιο συχνό τύπο νεοπλασμάτων του εγκεφάλου, περιλαμβάνουν όγκους με μεγάλο φάσμα βαθμών διαφοροποίησης. Ειδικά τα γλοιοβλαστώματα, παρά τη πληθώρα των θεραπευτικών προσπαθειών που έχουν γίνει για την αντιμετώπισή τους, χαρακτηρίζονται από ταχεία εξέλιξη και δυσμενή πρόγνωση. Η αποκωδικοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης, η οποία κρίνεται απαραίτητη για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών βιολογικών στρατηγικών αντιμετώπισης, θα επιτρέψει την στοχοποίηση συγκεκριμένων σταδίων-βημάτων σε αυτά τα μονοπάτια με σκοπό τη θεραπεία των αστροκυτωμάτων. Δύο από τα σημαντικότερα μονοπάτια σηματοδότησης, που απορρυθμίζονται συχνά στα διάφορα είδη κακοήθων όγκων, είναι τα μονοπάτια Ras/Raf/MEK/ERK (MAPK) και PI3K/AKT/mTOR. Το μονοπάτι σηματοδότησης Ras/Raf/MEK/ERK, το οποίο είναι εξαιρετικά συντηρημένο στην εξέλιξη των οργανισμών, εμπλέκεται σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η κυτταρική διαφοροποίηση και η μετανάστευση. Η ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού, που προκαλείται από μια ποικιλία σημάτων, οδηγεί στην ενεργοποίηση των RAF πρωτεϊνών μέσω της πρωτεΐνης Ras. Πιο συγκεκριμένα, η RAF πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη, ενεργοποιείται από την πρωτεΐνη Ras ως απόκριση στα διάφορα σήματα που δέχεται το κύτταρο. Στη συνέχεια, η ενεργοποιημένη RAF πρωτεΐνη φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την πρωτεΐνη MEK1/2, που με την σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τις εκτελεστικές MAP κινάσες ERK1 και ERK2. Οι ενεργοποιημένες κινάσες ERK1/2, που έχουν τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης περισσότερο από 100 διαφορετικών υποστρωμάτων όπως μεμβρανικές, κυτταροπλασματικές, κυτταροσκελετικές, ριβοσωμικές και πυρηνικές πρωτεΐνες (μεταγραφικοί παράγοντες), επηρεάζουν σε σημαντικό βαθμό την «μοίρα» των κυττάρων. Το μονοπάτι σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR, το οποίο παίζει ένα πολύπλοκο ρόλο στη βιολογία και στο μεταβολισμό του κυττάρου, συμμετέχει στη ρύθμιση της κυτταρικής αύξησης και στο κυτταρικό θάνατο. Η ενεργοποίηση της κινάσης PI3K μπορεί να προκύψει από τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων, όπως οι EGFR και IGF-1R, από τα μόρια της κυτταρικής προσκόλλησης, όπως οι ιντεγκρίνες, από τους υποδοχείς των G-συζευγμένων πρωτεϊνών (GPCRs), και από ογκογονίδια, όπως το ογκογονίδιο Ras. Η ενεργοποιημένη κινάση PI3K φωσφορυλιώνει τα λιπίδια της φωσφατίδυλο-ινοσιτόλης PIP2 μετατρέποντας τα στα λιπίδια PIP3. Τα τελευταία με την σειρά τους ενεργοποιούν σημαντικά εκτελεστικά υποστρώματα όπως η πρωτεΐνη AKT. Η πρωτεΐνη AKT που χαρακτηρίζεται απο την ικανότητα να φωσφορυλιωνει μια μεγάλη ποικιλία προ ογκογονικων πρωτεϊνών οι οποίες είτε ενεργοποιούν την κυτταρική αύξηση είτε αναστέλλουν την απόπτωση των κυττάρων φωσφορυλιωνει τις πρωτεΐνες TSC1 και TSC2 με αποτέλεσμα την καταστολή της ενεργοτητας του συμπλοκου TSC1 TSC2 και αρα την ενεργοποίηση του συμπλοκου mTORCl Η πρωτεΐνη mTOR ως κύριο συστατικό του συμπλοκου mTORCl είναι κεντρικός ρυθμιστής της πρωτεινοσυνθεσης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και της κυτταρικής επιβίωσης Δυο μόρια που ρυθμίζονται απο το συ μπλόκο mTORCl τα 4Ε ΒΡ1 και S6K1 είναι υπεύθυνα για τις παραπάνω λειτουργίες Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η αναζήτηση μεταλλαγών στο γονίδιο PIK3CA καθώς και των επίπεδων έκφρασης των πρωτεϊνών p-ERK, ρ AKT, ρ mTOR και ρ p70S6K στα διάχυτα διηθητικά αστροκυτωματα Η μελέτη άφορα 155 περιπτώσεις ασθενών με διάχυτο διηθητικό αστροκυτωμα που εξετάστηκαν για μεταλλαγές στο γονίδιο PIK3CA και εκτιμήθηκαν ανοσοιστοχημικα για την έκφραση των ρ ERK ρ AKT ρ mTOR και ρ p70S6K Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικα χαρακτηριστικά και την επιβίωσητων ασθενών με σκοπό την αναζήτηση της πιθανής προγνωστικής τους άξιας και τον καθορισμό της σχέσης των ευρημάτων με τη βιολογική συμπεριφορά των νεοπλασμάτων αυτών Η ανάλυση μεταλλαγών εντόπισε μεταλλαγές σε 2 περιπτώσεις απο τις 52 (3%) των γλοιοβλαστωματων στο εξωνιο 9 ενω καμία μεταλλαγή δεν ανιχνεύθηκε στο εξωνιο 20 του γονίδιου PIK3CA Καμία μεταλλαγή σε αυτά τα δυο εξωνια του γονίδιου PIK3CA δεν εντοπίστηκε στα διάχυτα και αναπλαστικα αστροκυτωματα που εξετάστηκαν Για την πρωτεΐνη ρ ERK παρατηρήθηκε πυρηνική έκφραση σε ποσοστό 98 8% (85/86) των περιστατικών και κυτταροπλασματικη σε ποσοστό 73 3% (63/86) ενω τα αντίστοιχα ποσοστά για την πρωτεΐνη ρ AKT ήταν 93 05% (67/72) και 59 7% (43/72) αντίστοιχα Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε συσχέτιση της πυρηνικής έκφρασης των pERK και ρΑΚΤ με την αντίστοιχη κυτταροπλασματικη έκφραση των pERK και ρΑΚΤ Επίσης τόσο η πυρηνική οσο και η κυτταροπλασματικη έκφραση της ρ ERK συσχετίστηκαν με τις αντίστοιχεςεκφράσεις της ρ AKT Η πυρηνική και η κυτταροπλασματικη έκφραση της ρ ERK καθώς και η πυρηνική της ρ AKT συσχετίστηκαν με την έκφραση του VEGF Τέλος παρατηρήθηκε συσχέτιση της κυτταροπλασματικης έκφρασης της ρ ERK με το μήκος ελάσσονος άξονα τη διάμετρο του Feret και με την αγγειακή επιφάνεια των μικροαγγειων Η έκφραση της ρ mTOR ήταν κυτταροπλασματικη και μεμβρανικη και παρατηρήθηκε στο 84 6% των περιστατικών που μελετήθηκαν ενω η έκφραση της ρp70S6K πρωτεΐνης ήταν πυρηνική και παρατηρήθηκε στο 100% των περιστατικών Η έκφραση της ρ mTOR συσχετίστηκε με την έκφραση της ρ p70S6K Επίσης η έκφραση της ρ mTOR συσχετίστηκε θετικά με το βαθμό κακοήθειας ενω η έκφραση της ρ p70S6K συσχετίστηκε οριακά με την ηλικία των ασθενών Τα αποτελέσματα της πολυπαραγοντικης ανάλυσης ανέδειξαν την πυρηνική έκφρασητης p-ERK και την κυτταροπλασματικη έκφραση της ρ AKT ως ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες που σχετίζονται με δυσμενή επιβίωση Συμπερασματικά παρατηρήθηκε χαμηλή συχνότητα μεταλλαγών στο γονίδιο PIK3CA πάρα την παρουσία ενεργοποιημένης μορφής της πρωτεΐνης AKT Επίσης, η συσχέτιση της έκφρασης των ρ ERK ρ AKT ρ mTOR και p-p70S6K με τακλινικοπαθαλογοανατομικα χαρακτηριστικά των όγκων και την επιβίωση των ασθενών μας οδηγούν στο συμπέρασμα πως αυτές οι πρωτεΐνες διαδραματίζουν πιθανώς κάποιο ρολό στην ογκογενεση των αστροκυτωματων καθώς και στην εμφάνιση ενός περισσότερο επιθετικού φαινοτύπου Τα δυο μονοπάτια σηματοδότησης PI3K/AKT/mTOR και RAS/RAF/MERK/ERK φαίνεται να συνεργάζονται με σκοπό την επαγωγή της ογκογενεσης των αστροκυτωματων γεγονός που καθίστα απαραίτητη τη διερεύνηση της πιθανής τους σημασίας ως θεραπευτικών στόχων.