Συσχέτιση της απορρύθμισης των γονιδίων HER2/NEU και PTEN με τη βιολογική συμπεριφορά του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου

Abstract

Purpose: The deregulation of the mollecullar signal transduction pathways to the core is subject of investigation for the mechanism of tumorigenesis and development of cancer. HER-2/NEU protein has an important part in PI3K/ Akt/m TOR signaling pathway with the activation of the Src/SH2 proteins, whom is competing the action of PTEN((lipid Phosphatase and TENsin homologue) maintaining the balance at the signal transduction pathway to the core. Our aim was to investigate correlation between HER2 and PTEN protein levels , the Her gene/Chr17 copies and their correlation with clinical data of colon cancer.Methοds: Sixty (n=60) paraffin-embedded primary CAs were cored at 1,5 mm diameter and transferred to the microarray block. Immunohistochemistry (IHC) was performed using anti-HER2 monoclonal antibody and anti-Pten polyclonal antibody. Chromogenic in situ hybridization (CISH) was performed using HER2 gene/ chromosome 17 centromeric probes. Results:At IHC, HER2 protein overexpression (score: 2+/3+) was observed in 20/60 (33.3%) and loss or low expression of PTEN protein was observed in 34/60(56,6%) cases. CISH analysis detected 11/60 (18.33%) amplified cases, whereas chromosome 17 aneuploidy (polysomy) was identified in 13/60 (21.66%) cases. Significant associations raised correlating HER2 expression to grade of the tumours (p=0.03), Chr 17 to stage (p=0.001), gene copies to protein expression (p=0.008), and also Chr 17 centromere signals to overall gene signals (p=0.001). Finally there was significant correlation of HER2 protein expresion and PTEN(P=0,002) Conclusion: Multiple HER2 gene copies lead to different protein expression patterns (score 1+ to 3+) but pure gene amplification is only a sub set of them. Identification of chromosome polysomy is a critical parameter in detecting original gene amplification in conventional one-colour CISH methods. In addition loss or low levels of PTEN protein in combination with the overexpression of HER2 protein(2+/3+) with mechanisms like gene amplification, is an important element in a possible management of a patient subset for the application of target therapy.

ΣΚΟΠΟΣ: Η απορρύθμιση των μοριακών οδών μεταγωγής σημάτων προς τον πυρήνα (signal transduction pathways) αποτελεί αντικείμενο εκτεταμένης έρευνας για την κατανόηση των μηχανισμών της καρκινογένεσης και εξέλιξης των συμπαγών κακοήθων νεοπλασμάτων. Η ογκοπρωτείνη HER2/neu διαδραματίζει κομβικό ρόλο στο σύστημα PI3K/ Akt/m TOR μέσω της ενεργοποίησης των πρωτεϊνών Src/SH2, τις οποίες ανταγωνίζεται η δράση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN (lipid Phosphatase and TENsin homologue) διατηρώντας την ισορροπία στο ρυθμό μεταβίβασης των μιτογόνων σημάτων προς τον πυρήνα. Σκοπός της βασικής αυτής έρευνας αποτέλεσε η ανάλυση της έκφρασης των πρωτεϊνών HER2 και PTEN, καθώς επίσης και σε επίπεδο HER2 γονιδίου/Chr17 και η συσχέτισή τους με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους της νόσου (αδενοκαρκίνωμα παχέος εντέρου). ΜΕΘΟΔΟΙ: Χρησιμοποιήθηκαν εξήντα (n=60), εμπεδωμένα σε κύβους παραφίνης, δείγματα ιστών από ασθενείς με επιβεβαιωμένα ιστολογικά πρωτοπαθή αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου. Συγκροτήθηκαν τρεις κύβοι παραφίνης με ενσωματωμένο το σύνολο των 60 όγκων και σε παραλληλογραμμική διάταξη (6x7) ιστικών κυλίνδρων διαμ 1.5mm. Ο κάθε όγκος αντιπροσωπεύονταν από 2 ιστικούς κυλίνδρους. Επακολούθησε μικροτόμηση σε τομές πάχους 2-3 μm. Ανοσοιστοχημεία(IHC) πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα mouse monoclonal anti- HER2(clone ΤΑΒ 250) και rabbit polyclonal anti-PTEN (PN37). Χρωμογόνος in situ υβριδισμός(CISH) πραγματοποιήθηκε ,για να διερευνηθεί η αστάθεια (αριθμητικές ανωμαλίες) χρωμοσωμάτων και ειδικών γονιδιακών θέσεων σχετιζόμενων με πιθανή εφαρμογή στοχευμένης θεραπείας (targeted therapy) στα αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε για το χρωμόσωμα (CHR 17) ιχνηθέτης (probes) που ανίχνευε το κεντρομερίδιο (αλληλουχίες α-δορυφορικού DNA), για δε το γονίδιο HER2, ιχνηθέτης αλληλουχιών DNA που κωδικοποιεί τις καταλυτικές υποδομές της αντίστοιχης πρωτεΐνης.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στην IHC, πρωτεϊνική υπερέκφραση του HER2 (αποτελέσματα: +2/+3 ) παρατηρήθηκε σε 20/60 (33,3%) περιπτώσεις, ενώ πλήρη απώλεια ή χαμηλή έκφραση της PTEN πρωτεΐνης είχαμε σε 34/60(56,6%) περιπτώσεις. Στην CISH ανάλυση γονιδιακή υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε 11/60 (18,33%) περιπτώσεις, ενώ ανευπλοειδία(πολυσωμία) του χρωμοσώματος 17 αναγνωρίστηκε σε 13/60(21,66%) περιπτώσεις. Σημαντικές στατιστικά συσχετίσεις βρέθηκαν σχετικά με την πρωτεϊνική έκφραση του HER2 με το βαθμό κακοήθειας των όγκων(p=0,03), Chr 17 με το στάδιο κατά Duke του όγκου (p=0,001), γονιδιακά αντίγραφα με πρωτεϊνική έκφραση(p=0,008) και ακόμα Chr17 σήματα κεντρομερών με τα συνολικά γονιδιακά σήματα(p=0,001). Τέλος βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στην Her2 πρωτεϊνική έκφραση και του PTEN(p=0,002).ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Πολλαπλά HER2 γονιδιακά αντίγραφα οδηγούν σε διαφορετικά σχέδια πρωτεϊνικής έκφρασης (αποτελέσματα 1+ με 3+) αλλά καθαρές γονιδιακές ενισχύσεις είναι μόνο μια μειονότητα από αυτές. Η αναγνώριση χρωμοσωμικής πολυσωμίας είναι μια κριτική παράμετρος για να ανιχνεύσει πραγματικές γονιδιακές ενισχύσεις σε συμβατικές ενός χρώματος CISH μεθόδους σχετιζόμενες ακόμα και με αυξημένο στάδιο της κακοήθειας. Παράλληλα απώλεια της έκφρασης ή μειωμένη παραγωγή της PTEN πρωτεΐνης σε συνδυασμό με την υπερέκφραση του HER2 (2+/3+) μέσω τροποποιητικών μηχανισμών όπως ενίσχυσης του γονιδίου αποτελεί κομβικό στοιχείο στην πιθανή διαχείριση υποκλάσματος ασθενών με εφαρμογή στοχευόμενης θεραπείας.