Επίδραση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας στην έκφραση τελομεράσης στον καρκίνο του μαστού

Abstract

The aim of this work was to study the effect of ionizing radiation on cell viability and on telomerase expression. The regulatory mechanisms of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression as well as telomerase activity were investigated in relation with breast cancer cells features. Breast cancer cell lines as well as samples from breast cancer patients, differing in their basic features (presence or absence of estrogen, progesterone and HER2 receptors, presence of wild-type or mutated p53 protein), were used in this study. Methods: hTERT expression and telomerase activity were measured by quantitative real-time PCR and TRAP assay, respectively. Cell viability was measured by MTT assay and cell cycle distribution by flow cytometry. The research of possible mutations within p53 gene was assessed by sequencing analysis and HER2, myc, p53, p21 protein expression analysis by Western blotting. hTERT and c-myc gene promoter activity was assessed by chromatin immunoprecipitation assay and hTERT and HER2 gene silencing by siRNA technology. A significant correlation was found between hTERT expression/telomerase activity and HER2 receptor presence. After irradiation of breast cancer cell lines and of breast cancer cells derived from fresh tissue samples, an increase of hTERT expression and telomerase activity was observed in HER2 positive cells only. hTERT knockdown led to increased radio-sensitivity, while HER2 knockdown led to downregulation of hTERT expression and increased radio-sensitivity. HER2 receptor was found to upregulate hTERT expression through activation of the PI3K/Akt signalling pathway and transcription factors NF-kB and c-myc. In conclusion, the presence of HER2 receptor could be an indicator of increased radio-resistance of breast cancer cells, through activation of oncogenes such as telomerase. The use of methods leading to hTERT or HER2 gene knockdown could help optimize therapeutic schemes.

Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης ιοντίζουσας ακτινοβολίας στην κυτταρική βιωσιμότητα και την έκφραση της τελομεράσης. Μελετήθηκαν οι μηχανισμοί ρύθμισης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT) και η δραστικότητα του ολοενζύμου σε σχέση με τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκαν καρκινικές κυτταρικές σειρές και δείγματα από ασθενείς με καρκίνο μαστού, που διέφεραν στα βασικά χαρακτηριστικά τους (παρουσία υποδοχέων οιστρογόνου, προγεστερόνης και HER2, παρουσία φυσιολογικής ή μεταλλαγμένης πρωτεΐνης p53). Μεθοδολογία: η έκφραση hTERT και η δραστικότητα τελομεράσης πραγματοποιήθηκαν με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο και το πρωτόκολο TRAP, αντίστοιχα. Η κυτταρική βιωσιμότητα πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της δοκιμασίας ΜΤΤ και η κατανομή των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής. Η ανίχνευση πιθανών μεταλλάξεων του γονιδίου p53 πραγματοποιήθηκε με αλληλούχιση σε γενετικό αναλυτή και η έκφραση των HER2, myc, p53, p21 με ανοσοαποτύπωση κατά Western. Η δραστηριότητα των υποκινητών των γονιδίων hTERT και c-myc πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης και η γονιδιακή αποσιώπηση της έκφρασης των γονιδίων hTERT και HER2, με την τεχνολογία παρεμβατικών μορίων RNA. Βρέθηκε υψηλή συσχέτιση μεταξύ επιπέδων έκφρασης hTERT και δραστικότητας τελομεράσης και της παρουσίας του υποδοχέα HER2. Μετά από ακτινοβόληση καρκινικών σειρών και δειγμάτων βιοψιών όγκων ασθενών με καρκίνο μαστού, διαπιστώθηκε αύξηση της έκφρασης hTERT και αυξημένη ενεργότητα του ενζύμου, αλλά και αυξημένη ανθεκτικότητα των ακτινοβολημένων HER2 θετικών κυττάρων μόνο. Η αποσιώπηση της έκφρασης της hTERT, οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην ακτινοβόληση, ενώ η αποσιώπηση της έκφρασης του HER2, σε μείωση της έκφρασης hTERT και αυξημένη ευαισθησία των κυττάρων στην ακτινοβόληση. Ο υποδοχέας HER2 βρέθηκε να ρυθμίζει την έκφραση της hTERT, μέσω ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3Κ/Akt και των μεταγραφικών παραγόντων NF-kB και c-myc. Συμπερασματικά, προτείνεται ότι η παρουσία του υποδοχέα HER2, θα μπορούσε να αποτελέσει δείκτη αυξημένης ανθεκτικότητας των όγκων στην ακτινοθεραπεία, μέσω της ενεργοποίησης ογκογονιδίων όπως η τελομεράση και ότι η χρήση τεχνολογιών καταστολής της έκφρασης της τελομεράσης ή του υποδοχέα HER2 θα μπορούσαν να συντελέσουν στην αύξηση της αποτελεσματικότητας θεραπευτικών σχημάτων.