Αντικαρκινική δράση φλαβονοειδών φυσικής προέλευσης και ημισυνθετικών παραγώγων τους σε ανθρώπινα πρότυπα καρκίνου in vitro και in vivo

Abstract

Flavonoids are plant derived products that have been reported to demonstrate cytotoxic activity in vitro while some have entered clinical trials. Recently, kaempferol glycoside was shown to interfere with MAPK signal transduction pathway. MAPK pathway regulates proliferation, survival, growth and motility of cells. p90 ribosomal S6 kinase (RSK) constitutes a family of protein kinases downstream of the MAP kinase cascade and has been shown to regulate cancer progression. We have investigated 16 different flavonols, including flavonol glycosides and their peracetylated derivatives for their ability to induce cytotoxicity and cell cycle perturbations towards solid tumor cells. Our aim was to approach the most cytotoxic flavonol. Further on we proceeded with the investigation of its mechanism of action and whether this compound acts downstream to MAPK pathway via RSK inhibition. Finally, we have evaluated the antitumor activity of peracetylated tiliroside (Tac) in the human tumor xenograft / immunodeficient mouse model and its relation to the regulation of the MAPK pathway. Antiproliferative activity was investigated using the SRB assay according to the NCI. Further, cell cycle perturbations were monitored by flow cytometry using propidium iodide staining. COMPARE algorithm was further employed for an initial evaluation of the mechanism of action. Tac induced perturbations on cell cycle were examined on the HCT116 cancer cell line using FACS analysis. Western blot was utilized for the detection of caspase activation and changes in the levels of kinases involved in MAPK. The in vivo antitumor activity of Tac was also evaluated against HCT116 xenografts. The examined flavonols showed weak activity while acetylation did not enhance their activity. Of all compounds tested Tac demonstrated significant antiproliferative and cytotoxic activity. Cell cycle perturbations were found similar between most compounds while induction of apoptosis was significant only on cells treated with Tac. COMPARE analysis of Tac activity revealed great similarities with DNA damaging agents. FACS analysis indicated that Tac treatment resulted in a delay swift of cells from G2- to M-phase, subsequent blockage in G1 phase, and apoptosis through caspase activation. Under these experimental conditions Tac did not affect MARKCS or ERK1/2 phosphorylation levels but did alter RSK’s activity as this was depicted by the elevated eEF2 phosphorylation. Intraperitoneal (ip) administration of Tac at the maximum tolerated dose (MTD), following a [(Q1D5) x 2] schedule significantly suppressed growth of HCT116 tumors in xenografts. Findings suggest that there is virtually limited linkage of the – OH groups of the aromatic ring B and of their acetylation, to the in vitro anticancer activity of the tested flavonols. In contrast, acetylation of tiliroside greatly improved the activity of this congener. Tac induced apoptotic cell death to HCT116 cell seems the result of a mechanism involving MAPK inhibition. COMPARE analysis revealed similarities of Tac mechanism of action to that of DNA damaging agents, thus linking RSK activity to DNA damage. Taken together the in vitro and in vivo results evaluate acetylated kaempferol glucosides as lead compounds for the development of substrate specific anticancer agents.

Τα φλαβονοειδή είναι φυτικά προϊόντα που έχουν δείξει αξιόλογη in vitro κυτταροτοξική δράση ενώ κάποια έχουν εισέλθει σε κλινικές μελέτες. Πρόσφατες μελέτες υπέδειξαν ένα γλυκοσίδη της καιμπφερόλης να εμπλέκεται στο μονοπάτι μεταγωγής σημάτων MAPK. Το MAPK ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την ανάπτυξη και την κινητικότητα των κυττάρων. Η p90 ριβοσωμική S6 κινάση (RSK) βρίσκεται κατάρρους της κινάσης ERK στο μονοπάτι MAPK και ρυθμίζει την ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Μελετήσαμε την ικανότητα 16 ουσιών; φλαβονολών, γλυκοσιδών και περακετυλιωμένα παράγωγα τους, να προάγουν κυτταροτοξική δράση και να επάγουν διαταραχές στον κυτταρικό κύκλο ανθρώπινων στέρεων όγκων. Απώτερος σκοπός ήταν η ανεύρεση της πιο κυτταροτοξικής φλαβονόλης. Στην συνέχεια, εξετάσαμε το μηχανισμό δράσης της ουσίας σε in vitro αλλά και in vivo πρότυπα ανθρώπινου καρκίνου, καθώς και την εμπλοκή της δράσης αυτής στο μονοπάτι σηματοδότησης MAPK μέσω αναστολής της δράσης της κινάσης RSK. Η αντιπολλαπλασιαστική δράση των ουσιών εξετάσθηκε με τη μεθοδολογίας της SRB. Οι διαταραχές στον κυτταρικό κύκλο εξετάσθηκαν με κυτταρομετρητή ροής ύστερα από χρώση με προπίδιο του ιωδίου. Ο αλγόριθμος COMPARE χρησιμοποιήθηκε για μια εκτίμηση του μηχανισμού δράσης της πιο δραστικής ουσίας, περακετυλιωμένος τιλιροσίδης (Tac), ενώ ο κυτταρικός θάνατος και οι διαταραχές στον κυτταρικό κύκλο μελετήθηκαν έναντι της καρκινικής σειράς HCT116, με κυτταρομετρία ροής. Η ενεργοποίηση των κασπασών και η μελέτη μηχανισμού δράσης εξετάσθηκε με ανοσοστύπωση. Η in vivo δράση του Tac εξετάσθηκε ξανά έναντι της καρκινικής σειράς HCT116. Οι φλαβονόλες και τα παράγωγα τους έδειξαν μέτρια αντιπολλαπλασιαστική δράση, ενώ η ακετυλίωση δεν βελτίωσε την δραστικότητα των παράγωγων τους. Από όλες τις ουσίες το Tac έδειξε την πιο αξιοσημείωτη αντιπολλαπλασιαστική δράση. Οι διαταραχές στον κυτταρικό κύκλο ήταν περίπου ίδιες για όλες τις ουσίες παρόλα αυτά κυτταρικός θάνατος επήλθε μονάχα στα κύτταρα που είχαν επωαστεί με Tac. O αλγόριθμος COMPARE υπέδειξε όμοιο μηχανισμό δράσης του Tac με γενοτοξικές ουσίες. Η μελέτη του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι το Tac επιφέρει καθυστερημένη μετάβαση των κυττάρων από την φάση G2/M με παράλληλη φραγή στην G1 ενώ ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος φάνηκε εξαρτώμενος από τη δράσης των κασπασών. Κάτω από τις συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες το Tac δεν επηρέασε τη δράση κινασών ανάρρους της RSK παρόλα αυτά έδειξε ότι πιθανά αναστέλλει τη δράση της RSK όπως φάνηκε από την ενεργοποίηση του παράγοντα eEF2. Ενδοπεριτονιακή χορήγηση του Tac στα ποντίκια μείωσε αξιοσημείωτα το ρυθμό ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του παχέως εντέρου, HCT116. Τα διαφορετικά δομικά χαρακτηριστικά των φλαβονολών αλλά και η ακετυλίωσης τους υπέδειξαν ελάχιστη επιρροή στην δράση τους. Σε αντίθεση, η ακετυλίωση του τιλιροσίδη ευνόησε αξιοσημείωτα τη δράση του προϊόντος επιφέροντας απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα η οποία δύναται να είναι αποτέλεσμα της εμπλοκής της ουσίας στο μονοπάτι MAPK. Τα ευρήματα από το COMPARE υπέδειξαν ομοιότητες στη δράση του Tac με ουσίες που παρεμποδίζουν την φυσιολογική εξέλιξη του γενετικού υλικού προσδίδοντας μια σχέση ανάλογη μεταξύ της γενοτοξικής δράσης της ουσίας και της επαγόμενης αναστολής της δράσης της RSK. Τα in vitro και in vivo αποτελέσματα αξιολογούν του γλυκοζίτες της καιμπφερόλης ως πρόδρομα μόρια για την ανάπτυξη στοχευμένων αντικαρκινικών φαρμάκων.