Επίδραση συστήματος φορέων ακινητοποίησης από αγροτοβιομηχανικά απορρίμματα σε βιοαντιδραστήρα πολλαπλών κλινών στην παραγωγή οίνου και οινοπνεύματος

Abstract

The main interest of this thesis was to propose an integrated system for alcoholand wine production, which would be advantageous as far as production cost andproduct quality are concerned.The biotechnological processes concerning wine making and alcoholproduction and particularly alcoholic fermentation, volatile flavour compounds andcell immobilization were reviewed in the first section of this thesis. After adescription of the materials and methods that were used, we continue with the resultsection.Brewer’s spent grains (BSG) a cheap and abundant waste of the brewingindustry has been selected as immobilization support. Several types of BSG (with andwithout chemical treatment) were evaluated and compared as supports for yeastimmobilization, for use in alcoholic fermentation of molasses, in terms of operationalstability, ethanol productivity, quality of the fermentation products, and costeffectiveness of the proposed processes. Finally the untreated BSG were selected asthe most suitable support and were used for all other experiments.The immobilized biocatalyst was introduced in an MFBT bioreactor and wasused for molasses fermentation at an extremely wide temperature range. More specificthe system was able to ferment 10 oBe molasses at 3-40 oC. To the best of ourknowledge this is the first report of ethanol production at such high concentrations attemperatures ranging 3-40 oC using non genetic modified strain of S. cerevisiae.These results led us to identify AXAZ-1 at the species level by sequencing analysis oftwo informative rDNA regions. Its genetic similarity to other wild andcommercialised S. cerevisiae strains was also evaluated through restriction analysis ofmtDNA. Strain AXAZ-1 was most closely related, though rather distant, to twostarters of exotic origin rather than to Greek isolates. It was also notable, that exceptthe high fermentation efficiency the system produced high quality products ought tothe low concentrations of higher and amyl alcohols at both high and low fermentationtemperatures.The same system was applied for continuous molasses fermentation, whereMFBT bioreactor was also compared with a PB bioreactor. The MFBT system wasadvantageous and the immobilized biocatalyst showed high operational stabilityduring 55 working days at 30-40 oC. Moreover, the obtained ethanol productivitieswere high, even at high fermentation temperatures. Same results were observed during32 days of continuous non-sterilized molasses fermentation, while concentrations ofvolatiles by-products remained at normal levels.The MFBT bioreactor with the BSG immobilized biocatalyst was also used forbatch type wine making. Ethanol and wine productivities were relatively high, whilethe major volatile by-products ranged in levels that contribute to the pleasant flavourof wines. GC-MS analysis confirmed the quality of the product at all studiedtemperatures, as the produced wines contained more esters than alcohols. This was akey point observation proving the suitability of the system for wine making at hotclimates.The next step was to produce wine at 10-40 oC in a continuous mode using theproposed system. The MFBT bioreactor with the BSG immobilized biocatalystshowed high operational stability during 96 days of continuous wine making. Volatileby-products concentrations were in the levels of commercial wines. These results inaddition with the obtained high ethanol and wine productivities made the systemsuitable for wine making in wide temperature range. More important was that S.cerevisiae AXAZ-1 cells immobilized on BSG, in combination with the MFBTbioreactor could be proposed for industrial use. This is due to the ability of the systemto work continuously throughout the year for both alcohol and wine production,making it cost effective.The final study was conducted in order to propose an alternative system, to beused in the case of BSG deficiency. The system included apple as immobilizationsupport, which was placed in half the floors of the MFBT bioreactor. The resultsshowed that the system could be used as an alternative without significant operational,economic and quality differences in comparison with the aforementioned system.The general conclusion of this thesis is that an integrated system composed ofan MFBT bioreactor, a unique S. cerevisiae (AXAZ-1) strain and an agro industrialwaste (BSG) as immobilization support, can be used for high quality wine and alcoholproduction. The distinctiveness of the proposed system is the ability to provide highproductivities and to produce quality products, with both batch and continuousfermentations at an extremely wide temperature range. This fact reduces the coolingdevice cost at a minimum level, which is very important for an industry. Furthermorethe system is capable to ferment throughout the year and even when the fermentationprocess stops, the disposal of the immobilized biocatalyst in the environment can beavoided as it can be used as an animal feed due to its rich in dietary fibers and proteincontent.

Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η δημιουργία ενός ολοκληρωμένουσυστήματος για παραγωγή οίνου και οινοπνεύματος, που θα προσφέρειαναμφισβήτητα πλεονεκτήματα όσον αφορά το κόστος της διεργασίας και τηνποιότητα του παραγόμενου προϊόντος.Στο πρώτο μέρος της διατριβής έγινε ανασκόπηση της βιβλιογραφίας πουαφορά τις βιοτεχνολογικές διεργασίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται μέχρι και σήμεραγια παραγωγή οίνου και οινοπνεύματος. Έμφαση δόθηκε στην αλκοολική ζύμωση, ταπαραγόμενα αρωματικά συστατικά και στην ακινητοποίηση κυττάρων. Επίσης γίνεταιαναφορά στις ιδιαιτερότητες των ζυμώσεων σε υψηλές και χαμηλές θερμοκρασίες.Κατόπιν περιγράφεται το πειραματικό μέρος που πραγματοποιήθηκε και μετάπαρουσιάζονται και σχολιάζονται τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων τηςδιατριβής. Καταρχάς έγινε επιλογή του φορέα ακινητοποίησης. &ς φορείςακινητοποίησης των κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν BSG, που είναι ένααγροτοβιομηχανικό απόρριμμα της ζυθοποιίας φθηνό, άφθονο και κατάλληλο γιατρόφιμα. Έγινε αξιολόγηση διαφόρων τύπων BSG (επεξεργασμένα ή μη) ως φορείςακινητοποίησης για παραγωγή αιθανόλης από μελάσσα, με γνώμονα την ποιότητατου προϊόντος, την παραγωγικότητα, την ευκολία χρήσης και το κόστος. Τελικάεπιλέχθηκαν τα BSG που δεν είχαν υποστεί καμία χημική επεξεργασία(απολιγνινοποίηση) για τη συνέχιση της έρευνας.Στη συνέχεια ο ακινητοποιημένος αυτός βιοκαταλύτης κατανεμήθει σεβιοαντιδραστήρα πολλαπλών σταθερών κλινών (MFBT) και χρησιμοποιήθηκε στηζύμωση μελάσσας σε ένα εξαιρετικά μεγάλο και πρωτοαναφερόμενο εύροςθερμοκρασιών. Συγκεκριμένα το σύστημα ήταν ικανό να ζυμώσει μελάσσα στο εύρος3-40 oC καθιστώντας το μοναδικό στο είδος του. Το γεγονός αυτό προσφέρει πολλάπλεονεκτήματα με κυριότερο το ότι, μειώνει αισθητά το κόστος συστημάτων ψύξης.Αυτή η ιδιότητα του S. cerevisiae ΑΧΑΖ-1 δεν έχει ξαναπαρουσιαστεί σε κανέναάλλο μη-γενετικά τροποποιημένο στέλεχος. Αυτό μας προέτρεψε για μοριακή τουταυτοποίηση, η οποία έδειξε πως το στέλεχος είναι πραγματικά μοναδικό. Μάλιστα,επέδειξε μεγαλύτερη γενετική ομοιότητα με εμπορικά τροπικά στελέχη, παρά μεελληνικής προέλευσης εμπορικές ή άγριες ζύμες. Σημαντικό ήταν επίσης πως εκτόςτων υψηλών παραγωγικοτήτων που παρατηρήθηκαν σε όλες τις θερμοκρασίεςζύμωσης με τη χρήση του προτεινόμενου συστήματος, το παραγόμενο προϊόν ήτανυψηλής ποιότητας, λόγω των χαμηλών συγκεντρώσεων ανώτερων αλκοολών.Το ίδιο αυτό σύστημα χρησιμοποιήθηκε για ζύμωση μελάσσας σε συνεχέςσύστημα, όπου έγινε και σύγκριση του MFBT με βιοαντιδραστήρα σταθερής κλίνης(PB), με τον πρώτο να πλεονεκτεί. Ο ακινητοποιημένος βιοκαταλύτης παρουσίασελειτουργική σταθερότητα για χρονική περίοδο 55 ημερών σε θερμοκρασίες ζύμωσης30 έως 40 oC. Το σύστημα μάλιστα έδωσε υψηλές παραγωγικότητες και στη συνεχήζύμωση μη-αποστειρωμένης μελάσσας. Στις 32 ημέρες συνεχούς λειτουργίας τουακόμα και σε υψηλές θερμοκρασίες δεν παρατηρήθηκε οποιαδήποτε μόλυνση, ενώ οισυγκεντρώσεις των πτητικών παραπροϊόντων κυμάνθηκαν σε απολύτως κανονικά-επιθυμητά επίπεδα.Εξίσου θετικά ήταν τα αποτελέσματα της χρήσης του ακινητοποιημένου BSGβιοκαταλύτη στην παραγωγή κρασιού σε αντιδραστήρα MFBT διαλείποντος έργου.Τα αποτελέσματα των αναλύσεων με GC-MS, αναδεικνύουν πως οι οίνου πουπαρασκευάστηκαν με το σύστημα που προτείνουμε μπορούν να χαρακτηριστούνκαλής ποιότητας. Ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία ζύμωσης το ισοζύγιο τωνεστέρων προς τις αλκοόλες εμφανίστηκε θετικό, γεγονός που είναι επιθυμητό για τηνποιότητα του παραγόμενου κρασιού. Επίσης η εμφάνιση ενώσεων που προσδίδουνδιακριτό, χαρακτηριστικό άρωμα στο κρασί ακόμα και στους 37 oC είναι πολύ θετικόαποτέλεσμα. Η χρησιμοποίηση του συστήματος MFBT είναι ελπιδοφόρα, ιδιαίτεραγια παραγωγή κρασιού σε θερμές χώρες όπου υπάρχουν μεγάλες διακυμάνσειςθερμοκρασίας. Το κρασί δεν παρουσίασε μεγάλες διάφορες όσον αφορά τη σύστασήτου είτε παράγεται σε συνήθεις είτε σε υψηλές θερμοκρασίες.Το σύστημα MFBT μελετήθηκε και για συνεχή παραγωγή κρασιού σεθερμοκρασιακό εύρος 10-40 oC. Το σύστημα επέδειξε αξιοσημείωτη λειτουργικήσταθερότητα και αντοχή, παρόλο το μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, αλλά και ροών πουμελετήθηκαν. Σε όλες τις θερμοκρασίες, οι συγκεντρώσεις των πτητικώνπαραπροϊόντων στο παραγόμενο κρασί κυμάνθηκαν σε επιθυμητά επίπεδα. Τογεγονός αυτό είναι πολύ σημαντικό, αφού η ποιότητα ενός κρασιού εξαρτάται από ταπεριεχόμενα πτητικά παραπροϊόντα. Το αποτέλεσμα αυτό σε συνδυασμό με τις πολύυψηλές, μεγαλύτερες από άλλα αντίστοιχα συνεχή συστήματα, ημερήσιεςπαραγωγικότητες κρασιού που επιτεύχθηκαν καθιστά το προτεινόμενο συνεχέςσύστημα κατάλληλο για παραγωγή κρασιού και μάλιστα σε μεγάλο εύροςθερμοκρασιών. Ακόμα όμως σημαντικότερο είναι πως τα ακινητοποιημένα κύτταραS. cerevisiae AXAZ-1 σε BSG σε συνδυασμό με τη χρήση αντιδραστήρα πολλαπλώνσταθερών κλινών (MFBT) γίνονται ακόμα ελκυστικότερα για βιομηχανική χρήσηακόμα και σε συνεχές σύστημα. Αυτό γιατί εκτός του πλεονεκτήματος των υψηλώνπαραγωγικοτήτων και μάλιστα σε μεγάλο θερμοκρασιακό εύρος, το σύστημα έχειδοκιμαστεί με επιτυχία και με αντίστοιχες συνθήκες και σε ζύμωση μελάσσας. Άρα ηλειτουργία του συστήματος καθ’όλη τη διάρκεια του έτους είναι εφικτή, γεγονός πουπολλαπλασιάζει τα οικονομικά οφέλη μιας βιομηχανίας.Τέλος μελετήθηκε σύστημα MFBT που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθείεναλλακτικά, αν υπάρξει πρόβλημα έλλειψης BSG. Χρησιμοποιήθηκε μήλο ωςφορέας ακινητοποίησης και ο βιοκαταλύτης κατανεμήθηκε στις μισές κλίνες τουαντιδραστήρα. Το σύστημα απεδείχθει ότι ήταν αποτελεσματικό για παραγωγήκρασιού χωρίς μεγάλες λειτουργικές, οικονομικές και ποιοτικές παρεκκλίσεις σεσχέση με το προαναφερθέν.&ς γενικό συμπέρασμα μπορούμε να πούμε ότι η παρούσα διατριβή προτείνειένα ολοκληρωμένο σύστημα για παραγωγή οινοπνεύματος και ποιοτικού κρασιού. Τοσύστημα αυτό περιλαμβάνει βιοαντιδραστήρα πολλαπλών σταθερών κλινών, έναμοριακά ταυτοποιημένο μοναδικό στέλεχος (S. cerevisiae AXAZ-1), και ένααγροτοβιομηχανικό απόβλητο (BSG) ως φορέα ακινητοποίησης. Η ιδιαιτερότητα τουσυστήματος είναι η ικανότητά του να παρέχει υψηλές παραγωγικότητες και ναπαράγει ποιοτικά προϊόντα με συνεχή ή ασυνεχή διεργασία σε εξαιρετικά μεγάλοεύρος θερμοκρασίας, χωρίς ως εκ τούτου να απαιτεί μεγάλο κόστος ψύξης. Επιπλέοντο σύστημα αυτό επέδειξε λειτουργική σταθερότητα για πολύ μεγάλο χρονικόδιάστημα, γεγονός επίσης πολύ σημαντικό. Τα πλεονεκτήματα του αυτά το καθιστούνκατάλληλο για βιομηχανική χρήση. Επιπλέον είναι σημαντικό να αναφέρουμε πωςμετά το τέλος των διεργασιών ζύμωσης μπορεί να αποφευχθεί η απόρριψη τουακινητοποιημένου βιοκαταλύτη στο περιβάλλον, αφού λόγω της πλούσιας σεπρωτεΐνες και διαιτητικές ίνες σύστασης του μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή.