Studies of Giardia-host interactions: role of cysteine-rich surface proteins

Abstract

Intestinal infections are one of the most serious public health problems on the planet, especially in developing countries where it is the leading cause of death in children under 5 years. Causes of intestinal infections are different types of bacteria, viruses and parasites. Parasites are one of the leading causes of intestinal infections worldwide and they affect people of all ages, especially children and people with weak immune systems. Infections caused by intestinal parasites can give rise to sporadic, isolated cases but also epidemics. The Giardia intestinalis parasite (also known as Giardia lamblia or Giardia duodenalis) is a parasitic protozoan with flagella transmitted by oral intake of contaminated water or food and which causes sporadic, endemic or epidemic outbreaks of the diarrheal disease giardiasis. Giardiasis is the most common parasitic disease that causes diarrhea and affects approximately 280 million people each year in many countries around the world, including Sweden. Around 1200-1500 cases of giardiasis are reported each year in Sweden, but most of them (70%) have been infected abroad. The disease is mainly associated with poor hygiene and inadequate water treatment. It can affect people of all ages, while high risk groups are young children, patients with any type of immune system impairment and travelers to countries with high Giardia prevalence. The parasite has a simple life cycle that contains two steps: a trophozoite that is the replicating form and the cyst which is the contagious form.Cysts can survive outside the host for long periods of time and are virulent, while trophozoites do not survive outside the host. The life cycle of the parasite begins with the intake of host cysts, activation of excystation due to high levels of gastric acid in the stomach and release of the exyzoite in the upper part of the small intestine caused by the effects of trypsin and bile salts. The excyzoite is then differentiated into four trophozoites. The trophozoites in turn adhere to the intestinal epithelium and multiply. When the trophozoites fall to the lower part of the small intestine or the large intestine, they form cysts again which are later excreted in the feces. In this way the cysts can spread in the environment and infect a new host. In most cases, the infection is asymptomatic, but clinical symptoms of the infection occurs 1-4 weeks after cyst ingestion. The symptoms of giardiasis are diarrhea, weight loss, anorexia, stomach cramps and aches, while fever and vomiting is less common. The disease can also become chronic with acute relapse. Giardiasis is associated with subsequent onset of irritable bowel syndrome (IBS) and chronic fatigue syndrome, and in young children the parasite can cause growth disorders. The clinical diagnosis of the disease is made by parasitic examination of feces where cysts, trophozoites or both forms are present. The diagnosis can also include endoscopy of the upper digestive tract, duodenal fluid and biopsies. Antigen detection tests are an easy and fast option but are more common in research environments than in routine clinical diagnosis. The treatment of giardiasis is done with the help of drugs, mainly metronidazole, mebendazole or tinidazole or a combination of these medicines. However, preventive work to avoid infection is the most important way of control. As previously mentioned, the cysts are quite resistant to severe environmental conditions and can survive for days in low-temperature water, while they can be inactivated by boiling and pasteurization. For drinking water, chlorination is not enough to destroy the cysts, while water treatment with filters has proved to be satisfactory as it can eliminate most cysts from the water. The parasite can be divided into 8 genetic groups (A-H) where only two of them (A and B) can infect humans. The parasite is polyploid with two copies of the 5 chromosomes in each nucleus. In this dissertation, genome sequencing of two newly isolated human genotype A isolates (AS175 and AS98) was performed and the genome was compared with the genotype A isolate WB, the first sequenced Giardia genome, which is now the reference genome (Paper I). Scattered genetic variations were identified among the three isolates, including isolate-specific protein coding sequences and a high level of nucleotide diversity in several multigenic families, such as VSP and HCMP genes. We also used an in vitro model for studies of parasite interactions with host intestinal epithelial cells (differentiated Caco-2 was used as model) to study the interplay between Giardia and the human host.We have identified secreted Giardia proteins released by Giardia trophozoites from two different genotypes (WB, GS) when interacting with Caco-2 cells (Paper II). We were also able to identify which proteins are released by the host cells during the interaction. Our results suggest that much of the communication during the host-parasite interaction is mediated by secreted proteins (Paper II). The same experimental system was used to study changes in the parasite transcriptome (Paper III) and proteome (Paper IV) of the parasite and intestinal epithelial cells. These studies have yielded an additional understanding of the parasite-host interactions in giardiasis. One previously poorly studied gene family (HCMPs) was specifically studied and characterized during interactions at both RNA and protein level (Paper III, IV).Our results indicate that this gene family is important in the interaction between parasite and host during Giardia infections. The dissertation has provided an additional understanding of Giardia-host interactions in vitro and the molecular mechanisms involved.

Οι εντερικές λοιμώξεις αποτελούν ένα από τα πιο σοβαρά προβλήματα της Δημόσιας Υγείας παγκοσμίως, με ιδιαιτέρως αυξημένη νοσηρότητα καιθνησιμότητα κυρίως σε αναπτυσσόμενες χώρες, όπου και χαρακτηρίζεται ως η κυριότερη αιτία θανάτου παιδιών κάτω των 5 ετών. Αιτίες εντερικώνλοιμώξεων είναι πολλά βακτήρια, ιοί καθώς και παράσιτα. Τα τελευταία μάλιστα αποτελούν μια από τις σημαντικότερες αιτίες εντερικών λοιμώξεων,σχεδόν σε όλο τον κόσμο, προσβάλλοντας όλες τις ηλικίες, κυρίως όμως παιδιά και άτομα με ασθενές ανοσοβιολογικό συστήματος. Τέτοιες λοιμώξεις μπορεί να αποτελούν σποραδικές περιπτώσεις καθώς και επιδημίες. Το παράσιτο Giardia intestinalis (επίσης γνωστό ως Giardia lamblia ή Giardia duodenalis) είναι ένα μαστιγοφόρο πρωτόζωο παράσιτο, το οποίο μεταδίδεται μέσω της κοπρανοστοματικής οδού, όπως επίσης και μέσω του μολυσμένου νερού ή φαγητού, προκαλώντας σποραδικά, ενδημικά ή επιδημικά κρούσματα της νόσου λαμβλίαση. Η λαμβλίαση (ή γιαρδίαση) είναι η πιο συνηθισμένη αιτία παρασιτώσεων του λεπτού εντέρου και προσβάλει περίπου 280 εκατομμύρια άτομα κάθεχρόνο σε πολλές χώρες ανά τον κόσμο, συμπεριλαμβανομένου και της Ελλάδας. Η νόσος συνδέεται κυρίως με κακές συνθήκες υγιεινής καιανεπαρκείς εγκαταστάσεις καθαρισμού του νερού. Μπορεί να προσβάλει άτομα όλων των ηλικιών, με κυριότερες ομάδες υψηλότερου κινδύνου ναχαρακτηρίζονται τα μικρά παιδία, οι ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς και οι ταξιδιώτες. Το παράσιτο παρουσιάζει έναν απλό κύκλο ζωής, ο οποίος περιλαμβάνει δύο στάδια: τον τροφοζωΐτη που αποτελεί την βλαστική μορφή και τηνκύστη που αποτελεί την μολυσματική μορφή. Οι κύστες μπορούν να επιβιώσουν εκτός του ξενιστή οργανισμού για μεγάλες χρονικές περιόδουςκαι έχουν λοιμογόνο ικανότητα, ενώ οι τροφοζωΐτες δεν επιβιώνουν εκτός του ξενιστή. Ο κύκλος ζωής του παρασίτου ξεκινάει με την κατάποση των κύστεων από τον ξενιστή, οι οποίες ενεργοποιούνται από το αυξημένο γαστρικό υγρό και διαφοροποιούνται σε δύο τροφοζωΐτες. Οι τροφοζωΐτες με την σειρά τους προσκολλώνται στα επιθήλια του λεπτού εντέρου και πολλαπλασιάζονται. Καθώς οι τροφοζωΐτες προχωρούν στο κατώτερο μέρος του παχέος εντέρου σχηματίζουν κύστες, οι οποίες και αποβάλλονται με τα κόπρανα. Με αυτόν τον τρόπο οι κύστες μπορούν να φτάσουν στους υδροφόρους ορίζοντες και να προσβάλουν έναν καινούριο ξενιστή. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων η λαμβλίαση είναι ασυμπτωματική, παρ’ όλα αυτά κλινικά συμπτώματα της λοίμωξης μπορούν να εμφανιστούν 1-4 εβδομάδες μετά την λήψη/κατάποση των κύστεων. Τα συμπτώματα της λαμβλίασης περιλαμβάνουν διάρροια, καταβολή, απώλεια βάρους, ανορεξία, κοιλιακές κράμπες και άλγη, ενώ ο πυρετός και οι έμετοι είναι λιγότερο συνήθεις. Η νόσος μπορεί να μεταπέσει σε χρόνια, ενώ μπορεί να εμφανίσει και υποτροπές. Η λαμβλίαση σχετίζεται με την μετέπειτα εμφάνιση του συνδρόμου ευερέθιστου εντέρου (IBS) και του συνδρόμου χρόνιας κόπωσης, ενώ σε μικρά παιδιά μπορεί να προκαλέσει διαταραχές στην ανάπτυξη. Η κλινική διάγνωση της νόσου γίνεται με παρασιτολογική εξέταση κοπράνων για ανεύρεση κύστεων, τροφοζωϊτών ή και των δύο. Επιπλέον, η διάγνωση μπορεί να περιλαμβάνει και ενδοσκόπηση του ανώτερου πεπτικού συστήματος, λήψη δωδεκακτυλικού υγρού και βιοψίας. Αν και τα τεστ ανίχνευσης αντιγόνων αποτελούν μια εύκολη και γρήγορη εναλλακτική, ωστόσο εντοπίζονται συνήθως σε ερευνητικές εγκαταστάσεις και όχι για κλινικές διαγνώσεις.Η θεραπεία της λαμβλίασης περιλαμβάνει τη χρήση φαρμάκων με κύριο συστατικό την μετρονιδαζόλη, νιταζοξανίδη ή τινιδαζόλη ή ακόμα και συνδυασμό φαρμάκων. Παρ’ όλα αυτά, η πρόληψη αποτελεί τον πιο σημαντικό τρόπο ελέγχου της λοίμωξης.Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι κύστες είναι αρκετά ανθεκτικές σε σκληρές περιβαλλοντικές συνθήκες, επιβιώνοντας για ημέρες σε νερά χαμηλής θερμοκρασίας, ενώ μπορούν να αδρανοποιηθούν με το βράσιμο, την ξηρασία και την παστερίωση. Για το πόσιμο νερό, η χλωρίωση δεν είναι ικανή να καταστρέψει τις κύστες, ενώ αντιθέτως η επεξεργασία του νερού με φίλτρα έχει αποδειχτεί ικανοποιητική μέθοδος, καθώς είναι ικανή να κατακρατήσει το μεγαλύτερο ποσοστό των κυστών. Πηγή του παρασίτου είναι ο άνθρωπος αλλά και διάφορα θηλαστικά, κυρίως μηρυκαστικά και οικόσιτα ζώα, όπως επιπροσθέτως πουλιά και ποντίκια. Το παράσιτο Giardia παρουσιάζει 8 γονότυπους (A-H), ενώ μόνο δύο από αυτούς (A και B) μπορούν να προσβάλλουν τους ανθρώπους. Το παράσιτο είναι πολυπλόο με δύο αντίγραφα των 5 χρωμοσωμάτων σε κάθε πυρήνα. Σε αυτή τη διατριβή, διεξήχθη μελέτη ολόκληρου του γονιδιώματος για δύο ανθρώπινα στελέχη του γονότυπου A (AS175 και AS98), τα οποία συγκρίθηκαν τόσο μεταξύ τους όσο και με το γονιδίωμα του WB, το οποίο αποτελεί το στέλεχος αναφοράς (Δημοσίευση Ι - Paper I). Γενετικές διαφορές εντοπίστηκαν μεταξύ των τριών απομονωθέντων στελεχών, περιλαμβανομένων κωδικοποιητικών αλληλουχιών πρωτεϊνών μοναδικών για το κάθε στέλεχος καθώς απίσης και αυξημένος αριθμός νουκλεοτιδικής ποικιλότητας σε πολυγονιδιακές οικογένειες, όπως επί παραδείγματι οι VSPs και οι HCMPs. Περαιτέρω, χρησιμοποιήθηκε ένα in vitro μοντέλο για την αλληλεπίδραση των παρασίτων με ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα (IECs), προκειμένου να μελετηθεί η σχέση μεταξύ του παρασίτου Giardia και του ανθρώπινου ξενιστή. Μέσα από τη χρήση αυτού του μοντέλου εντοπίστηκαν τα κύρια εκκριτικά προϊόντα (ESPs) από δύο ανθρώπινα στελέχη της Giardia (WB, GS), όταν αυτά αλληλεπίδρασαν με τα επιθηλιακά κύτταρα Caco-2 (Δημοσίευση II - Paper II). Επίσης προσδιορίστηκαν ποιες πρωτεΐνες απελευθερώνονται από το κύτταραξενιστές κατά τη διάρκεια της αλληλεπίδρασης. Τα αποτελέσματά αυτής της έρευνας δείχνουν ότι μεγάλο μέρος της επικοινωνίας μεταξύ ξενιστήπαρασίτου προκαλείται από τις εκκρινόμενες πρωτεΐνες (Δημοσίευση II - Paper II). Το ίδιο πειραματικό μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθούν οι μεταβολές στο μεταγράφωμα του παρασίτου (Δημοσίευση ΙΙΙ - Paper III) και στο πρωτεΐνωμα (Δημοσίευση IV - Paper IV) του παρασίτου και των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων, προσφέροντας περαιτέρω κατανόηση της αλληλεπίδρασης παρασίτου-ξενιστή. Ιδιάιτερη προσοχή δόθηκε στη μελέτη και στον εις βάθος χαρακτηρισμό της πολυγονιδιακής οικογένειας HCMPs κατά τη διάρκεια αυτών των αλληλεπιδράσεων τόσο σε επίπεδο RNA όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (Δημοσίευση ΙΙΙ, IV - Paper III, IV). Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι αυτή η οικογένεια γονιδίων είναι σημαντική στην αλληλεπίδραση μεταξύ του παρασίτου και ξενιστή κατά τη διάρκεια λοιμώξεων από Giardia. Συμπερασματικά, η διατριβή μπορεί να παράσχει μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ Giardia-ξενιστή σε in vitro συνθήκες, καθώς επίσης και των μοριακών μηχανισμών που λαμβάνουν μέρος σε αυτές.

Tarminfektioner är ett av de allvarligaste folkhälsoproblemen på planeten, särskilt i utvecklingsländer där det är den främsta orsaken till dödsfall hos barn under 5 år. Orsaker till tarminfektionerna är olika typer av bakterier, virus och parasiter. Parasiter är en av de viktigaste orsakerna till tarminfektioner över hela världen och dem påverkar människor i alla åldrar, särskilt barn och människor med svagt immunförsvar. Infektioner orsakade av tarmparasiter kan ge upphov till sporadiska, isolerade fall men även epidemier. Giardia intestinalis parasiten (även känd som Giardia lamblia eller Giardia duodenalis) är en parasitär protozo med flageller som överförs genom oral transmission i förorenat vatten eller mat och som orsakar sporadiska, endemiska eller epidemiska utbrott av diarrrésjukdomen giardiasis. Giardiasis är den vanligaste parasitära sjukdomsorsaken till diarrrébesvär och påverkar cirka 280 miljoner människor varje år i många länder runt om i världen, inklusive Sverige. Det rapporteras 1200-1500 fall av giardiasis varje år i Sverige, men de flesta (70%) har smittats utomlands. Sjukdomen är huvudsakligen förknippad med dålig hygien och otillräckliga vattenreningsanläggningar. Det kan påverka människor i alla åldrar, medan hög riskgrupper är unga barn, patienter med någon typ av nedsättning i immunsystemet och resenärer till länder med höga Giardia prevalenser. Parasiten har en enkel livscykel som innehåller två steg: en trofozoit som är den replikerande formen och cystan som är den smittsamma formen. Cystor kan överleva utanför värden under långa perioder och är virulenta, medan trofozoiter inte överlever utanför värden. Parasitens livscykel börjar med cystornas intag av värden, aktivering av excystering av den sura magsaften i magen och frigörande av exyzoiten i övre delen av tunntarmen efter påverkan av trypsin och gallsalter. Excyzoiten differentieras sedan till fyra trofozoiter. Trofoziterna i sin tur håller sig vid tarmens epitel och multiplicerar. När trofozoiterna faller ned till tunntarmens nedre del eller tjocktarmen bildar de cystor igen som senare utsöndras med avföringen. På detta sätt kan cystorna spridas i närmiljön och infektera en ny värd. I de flesta fall är infektionen icke-symptomatisk, men kliniska symtom av infektionen inträffar 1-4 veckor efter cystintaget. Symptomen av giardias är diarré, viktminskning, anorexi, magkramper och värk, medan feber och kräkningar är mindre vanliga. Sjukdomen kan också bli kronisk med akuta återfall. Giardiasis är förknippad med senare uppkomster av irritabelt tarm syndrom (IBS) och kronisk trötthetssyndrom, och hos unga barn kan parasiten orsaka tillväxtsstörningar. Den kliniska diagnosen av sjukdomen görs genom parasitundersökning av avföring för att hitta cystor, trofozoiter eller båda formerna. Diagnosen kan också innefatta endoskopi i övre matsmältningsorganen, duodenalvätska och biopsier. Antigendetektionstester är ett enkelt och snabbt alternativ men är vanligare i forskningsmiljöer än i klinisk rutindiagnostik. Behandlingen av giardiasis görs med hjälp av läkemedel, huvudsakligen metronidazol, mebendazol eller tinidazol eller en kombination av dessa läkemedel. Förebyggande arbete med att förhindra infektion är dock det viktigaste sättet att kontrollera infektionen. Som tidigare nämnts är cystorna ganska resistenta mot svåra miljöförhållanden och kan överleva i dagar i lågtemperaturvatten, medan de kan inaktiveras genom kokning och pastörisering. För dricksvatten är klorering inte tillräckligt för att förstöra cystorna, medan vattenbehandling med filter har visat sig vara tillfredsställande eftersom det kan eliminera de flesta cystorna från vattnet. Parasiten kan delas in i 8 genetiska grupper (A-H) där endast två av dem (A och B) kan infektera människor. Parasiten är polyploid med två kopior av de 5 kromosomerna i varje kärna. I denna avhandling utfördes genomsekvensering av två nyisolerade humana genotyp A-isolat (AS175 och AS98) och genomen jämfördes med genotyp A isolatet WB, det först sekvenserade Giardia genomet som nu är referengenom (Papper I). Genomspridda genetiska variationer identifierades bland de tre isolaten, inklusive isolatspecifika proteinkodande sekvenser och en hög nivå av nukleotiddiversitet hos flera multigenfamiljer, såsom VSP och HCMP gener. Vi använde vidare en in vitro-modell för studier av parasitinteraktioner med värdens intestinala epitelceller (diffrentierade Caco-2 användes som modell) för att studera samspelet mellan Giardia och den mänskliga värden. Vi har identifierat de mest utsöndrade Giardia proteinerna som frisätts av Giardia trofozoiter från två olika genotyper (WB, GS) när de interagerar med Caco-2 celler (Papper II). Vi kunde också identifiera vilka proteiner som frigörs av värdcellerna under interaktionen. Våra resultat tyder på att mycket av kommunikationen vid värd-parasitinteraktionen medieras av sekreterade proteiner (Papper II). Samma experimentella system användes för att studera förändringar i parasit transkriptomet (Papper III) och proteomen (Papper IV) av parasiten och intestinala epitelceller. Dessa studier har gett oss en ytterligare förståelse av parasit-värdinteraktionerna vid giardiasis. En tidigare lite studerad genfamilj (HCMPer) studerades specifikt och karakteriserades under interaktioner på både RNA och proteinnivå (Papper III, IV). Våra resultat indikerar att denna genfamilj är viktig i samspelet mellan parasit och värd under Giardia infektioner. Avhandlingen har gett en ytterligare förståelse av Giardia-värd-interaktioner in vitro och de involverade molekylära mekanismerna.