Biological and immunological activities of probiotic microorganisms in models of inflammation and cancer

Abstract

Disorders of the gastrointestinal track, such as inflammatory bowel disease and colorectal cancer, are a substantial health hazard with high incidence and fatality rate. There is an association between the two, since patients suffering from inflammatory bowel disease have a higher risk of developing cancer, arising from chronic inflammation. Although the cause of the disease is not fully understood, exposure of susceptible individuals to environmental factors, such as the westernized diet, smoking, low physical activity and obesity, plays a crucial role. The prevalence of inflammatory disorders is one of the reasons that colorectal cancer incidence rate has spiked in the last decades, and although the mortality rate has been significantly reduced, cancer-related mortality worldwide has increased. In recent years intestinal microbiota have been identified as an important aspect involved in the emergence and progression of inflammatory bowel disease and colorectal cancer. The human microbiota comprises from trillion of bacteria, most of them in a commensal relationship with the host. However, disruption of the intestinal homeostasis can lead to dysbiosis and expansion of pathogenic microorganism that negatively affect the developmentof inflammatory conditions and neoplasia as well as response to therapeutic intervention against these disorders. Probiotic bacteria are defined as "live microorganisms that when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host". They have been shown to not only regulate the intestinal micro flora promoting homeostasis, but also prevent and ameliorate the course of digestive disorders, through a variety of ways. In this study we used the characterized probiotic strain Lactobacillus casei ATCC393 in various in vitro and in vivo models of inflammation and cancer in order to investigate its beneficial effects and the mechanisms implicated in them. Treatment of LPS-stimulated RAW 264.7 cells with the probiotic did not reduce their inflammatory potential, as expression of inflammation-related genes was not reduced. On the other hand, oraladministration of the microorganism ameliorated symptoms of DSS-induced colitis in BALB/c mice. Histological examination of the colon revealed lesions of milder severity and extent in the animals that had received lactobacilli. In addition, consumption of the probiotic beneficially modulated inflammatory cytokines in the large intestine reducing expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α, and altered the ratio of infiltrated immune cells in the ulcerative lesions in favour of regulatory T lymphocytes with decreased numbers of neutrophils being present. Overall, L. casei promoted the progression of the inflammatory response into the process of healing and restoration of mucosal dysplasia. Next we examined the growth inhibitory activity of L. casei in colon cancer cells. Treatment with the microorganism induced a time- and concentration-dependent inhibitory effect on the viability of CT26 and HT29 cells, as did to a lesser extent cell-free supernatants of L. caseicultures. Incubation with live lactobacilli induced apoptosis of cancer cells, evident by the activation of the major effector caspase 3 and cleavage of PARP1. In addition, alterations in the expression and activity of various apoptosis- and proliferation-related proteins in favour of apoptosis was detected in HT29 cells, including down-regulation of survivin and phosphorylation of HSP27 and Akt, while simultaneously an increased phosphorylation of Chk2, p38 and p53 was observed. Immunogenic signalling, able to elicit adaptive immune responses against dying cell-derived antigens was noted, with the release of HMGB1 from the nucleus and the exposure of calreticulin on the plasma membrane of cancer cells. Administration of L. casei in a syngeneic colon adenocarcinoma model resulted in a significant tumor inhibitory effect, as tumor volume of treated animals was reduced by approximately 60%. Examination of the intestinal microbiota revealed alterations mostly concerning less abundant microorganisms that could be related to the suppression of tumor overgrowth. More prominent was the immunomodulatory effect of lactobacilli consumption, as potent Th1 and cytotoxic T cell responses were detected. The number of cytotoxic T cells was increased and production of IFN-γ was elevated in the tumor and systemically. IL-12 and IL-1β were also up-regulated in the tumor of treated animals, as were many chemokinesresponsible for immune cell trafficking and infiltration in the tumor; and primarily ligands of the receptors CCR5 and CXCR3 such as CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 and CXCL11. Accumulation of CD8+T lymphocytes in the tumor was observed (infiltration) and cytotoxicity against tumor cells was increased in lactobacilli-fed mice as evidenced by the elevation of caspase 3 and PARP-1 cleavage in cells of the tumor tissue. These data support that oral administration of Lactobacillus casei plays a significant role in immune function, inducing Th1 immune responses, indicated by the up-regulation in IFN-γ and IL-12 production, as well as augmented CD8+T lymphocyte infiltration in the tumor, resulting in suppression of tumor growth. Overall, our data show that consumption of the probiotic Lactobacillus casei has beneficial protective effects in preclinical experimental models of intestinal inflammation and colon cancer. Further investigations are needed to better understand the exact role of L. casei in immune function and diseases, especially in the initial stages of inflammation-related neoplasia, either directly or by modulation of the overall intestinal community. Examination of possible synergistic effects with existing chemotherapeutic and immunotherapeutictreatments is a promising field and could result in the utilization of cocktails with beneficial bacteria as immunoadjuvant agents in future therapeutic regimens.

Οι διαταραχές του γαστρεντερικού συστήματος, όπως οι φλεγμονώδεις νόσοι του εντέρου και ο καρκίνος του παχέος εντέρου, αποτελούν μείζονα προβλήματα υγείας με υψηλά ποσοστά κρουσμάτων και θνησιμότητας. Υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των δύο, καθώς ασθενείς που πάσχουν από φλεγμονώδεις παθήσεις του εντέρου παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παχέος εντέρου ως αποτέλεσμα της χρόνιας φλεγμονής. Αν και η αιτία των φλεγμονωδών παθήσεων δεν είναι πλήρως κατανοητή, η έκθεση ευπαθών ατόμων σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η δυτική διατροφή, το κάπνισμα, η έλλειψη άσκησης και η παχυσαρκία, παίζει σημαντικό ρόλο. Η γενικευμένη εξάπλωση των φλεγμονωδών παθήσεων του εντέρου είναι ένας από τους λόγους που ο καρκίνος του παχέος εντέρου παρουσιάζει σημαντική αύξηση τις τελευταίες δεκαετίες, και παρόλο που τα ποσοστά θνησιμότητας έχουν μειωθεί, οι θάνατοι ασθενών με καρκίνο έχουν αυξηθεί παγκοσμίως. Τα τελευταία χρόνια η εντερική μικροχλωρίδα έχει ταυτοποιηθεί σαν σημαντικός παράγοντας που εμπλέκεται στην ανάπτυξη και πορεία των δυο αυτών διαταραχών. Το ανθρώπινο μικροβίωμα αποτελείται από τρισεκατομμύρια βακτήρια, τα περισσότερα από τα οποία βρίσκονται σε συμβιωτική σχέση με τον ξενιστή. Παρόλα αυτά, η διαταραχή της ομοιόστασης μεταξύ ξενιστή και συμβιωτικών μικροοργανισμών μπορεί να οδηγήσει σε δυσβίωση και εξάπλωση παθογόνων στελεχών που προωθούν την ανάπτυξη χρόνιας φλεγμονής και δυσπλασίας, και επηρεάζουν αρνητικά την απόκριση του ασθενή στη θεραπευτική αγωγή. Τα προβιοτικά ορίζονται ως «μικροοργανισμοί που όταν χορηγούνται σε επαρκείς ποσότητες επάγουν θετικές αποκρίσεις για την υγεία του ξενιστή». Έχει παρατηρηθεί ότι από τη μια πλευρά μπορούν να ρυθμίζουν την εντερική μικροχλωρίδα, επάγοντας τη διατήρηση της ομοιόστασης, και από την άλλη ταυτόχρονα αποτρέπουν και ελαττώνουν τα συμπτώματα των πεπτικών διαταραχών με διάφορους τρόπους. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήσαμε το ταυτοποιημένο προβιοτικό στέλεχος Lactobacillus casei ATCC393 σε in vitro και in vivo μοντέλα φλεγμονής και καρκίνου για να ελέγξουμε τις ευεργετικές του ιδιότητες και τους μηχανισμούς που ενέχονται σε αυτές. Συγκαλλιέργεια του προβιοτικού με κύτταρα RAW264.7 μετά από διέγερση με λιποπολυσακχαρίτες δεν ελάττωσε το δυναμικό της φλεγμονώδους απόκρισης των κυττάρων, καθώς δεν παρατηρήθηκε μείωση στην έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη φλεγμονή. Παρόλα αυτά, η από του στόματος χορήγηση του μικροοργανισμού βελτίωσε τα συμπτώματα της επαγώμενης από DSS κολίτιδας σε μύες BALB/c. Ιστολογικές παρατηρήσεις του παχέος εντέρου αποκάλυψαν ότι η ομάδα που έλαβε το προβιοτικό εμφάνιζε γενικά αλλοιώσεις ηπιότερης έντασης και έκτασης. Επίσης, η κατανάλωση του λακτοβακίλου επέδρασε ευεργετικά στην έκφραση προφλεγμονωδών κυτταροκινών μειώνοντας την έκφραση των ιντερλευκινών IL-1β, IL-6 και TNF-α, και μεταβάλλοντας την αναλογία των κυττάρων του ανοσοποιητικού στις τυπικές πυοκοκκιωματώδεις αλλοιώσεις της ελκωτικής κολίτιδας, αυξάνοντας τη παρουσία ρυθμιστικών Τ λεμφοκυττάρων και μειώνοντας τους αριθμούς των ουδετερόφιλων. Συνολικά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι ελκωτικές αλλοιώσεις της κολίτιδας των ποντικών που έλαβαν το προβιοτικό βακτήριο βρίσκονταν σε πιο προχωρημένο στάδιο εξέλιξης της φλεγμονής και επούλωσης των βλαβών του βλενογόννου. Στη συνέχεια εξετάσαμε την αντι-πολλαπλασιατική δράση του L. casei σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η επώαση με τον μικροοργανισμό παρουσίασε χρόνο- και δόσο-εξαρτώμενη αναστολή της βιωσιμότητας των CT26 και ΗΤ29 κυττάρων, κάτι που παρατηρήθηκε, αλλά σε μικρότερο βαθμό και με τη χρήση υπερκειμένων καλλιεργειών L. casei. Επώαση με ζώντες λακτοβάκιλους επέφερε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο καρκινικών κυττάρων, που παρατηρήθηκε με την ενεργοποίηση της εκτελεστικής κασπάσης 3 και διάσπαση της πρωτεΐνης PARP1. Επίσης, η έκφραση και η τροποποίηση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό ανιχνεύτηκαν σε κύτταρα HT29 με το συνολικό ισοζύγιο να είναι υπέρ του αποπτωτικού θανάτου. Αυτές οι τροποποιήσεις περιλαμβάνουν υπο-έκφραση της survivin και μειωμένη φωσφορυλίωση των HSP27 και Akt. Αντίθετα, αυξημένη ήταν η φωσφορυλίωση των Chk2, p38 και p53. Παρατηρήθηκε ανοσογονική σηματοδότηση ικανή να επάγει έμφυτες ανοσολογικές αποκρίσεις έναντι αντιγόνων θανόντων κυττάρων με την απελευθέρωση της HMGB1 από τον πυρήνα και την έκθεση της καλρετικουλίνης στην κυτταροπλασματική μεμβράνη.Η χορήγηση του L. casei σε συγγονικό μοντέλο αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου οδήγησε σε σημαντική μείωση του σχηματιζόμενου όγκου, καθώς το μέγεθος του όγκου στα πειραματόζωα που έλαβαν το προβιοτικό ήταν μειωμένο κατά περίπου 60%. Ο έλεγχος της εντερικής μικροχλωρίδας των ποντικών αποκάλυψε μεταβολές κυρίως σε πληθυσμούς μικροοργανισμών που ανιχνεύτηκαν με μικρότερη συχνότητα και είναι πιθανόν να σχετίζονται με την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Περισσότερο έντονη ήταν η ανοσοτροποποιητική δράση της κατανάλωσης λακτοβακίλλων, καθώς εντοπίστηκαν έντονες Th1 αποκρίσεις. Παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων στον όγκο, και αυξημένη παραγωγή IFN-γ τοπικά στον όγκο αλλά και συστημικά. Οι κυτταροκίνες IL-12 και IL-1β ήταν επίσης αυξημένες στους όγκους των ποντικών που έλαβαν το προβιοτικό, καθώς επίσης και χημειοκίνες υπεύθυνες για την μετανάστευση και διήθηση κυττάρων του ασοσοποιητικού στον όγκο. και κυρίως προσδέτες των υποδοχέων CCR5 και CXCR3, όπως οι CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10 και CXCL11. Παρατηρήθηκε συσσώρευση διηθητικών CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στον όγκο και η κυτταροτοξική δράση έναντι καρκινικών κυττάρων ήταν ενισχυμένη, όπως φαίνεται από την αύξηση της διάσπασης της κασπάσης 3 και της PARP1. Τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η από του στόματος χορήγηση του Lactobacillus casei διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος• επάγοντας Th1 ανοσολογικές αποκρίσεις, όπως φαίνεται από την αύξηση των κυτταροκινών IFN-γ και IL-12, καθώς και αυξημένο αριθμό διηθητικών CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στον όγκο, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της έρευνας υποδεικνύουν ότι η κατανάλωση του προβιοτικού βακίλου Lactobacillus casei έχει ευεργετικές και προστατευτικές δράσεις σε προκλινικά συγγονικά μοντέλα φλεγμονής και καρκίνου του εντέρου. Επιπρόσθετες μελέτες θα βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση του ρόλου του L. casei στη λειτουργία του ανοσοποιητικού και στην πορεία των διαταραχών, ειδικά κατά τα πρωταρχικά στάδια της νεοπλασματικής νόσου που σχετίζεται με τη χρόνια φλεγμονή, είτε απευθείας είτε μέσω τροποποίησης της εντερικής μικροχλωρίδας. Η διερεύνηση πιθανής συνεργιστικής δράσης του μικροοργανισμού με χημειοθεραπείες και ανοσοθεραπείες είναι ένα πολλά υποσχόμενο πεδίο και είναι πιθανόν να καταλήξει στην αξιοποίηση μειγμάτων ευεργετικών βακτηρίων με ανοσοενισχυτική δράση σε μελλοντικά θεραπευτικά σχήματα.