Μελέτη της δράσης προβιοτικών μικροοργανισμών σε λειτουργικά τρόφιμα

Abstract

Recent studies showed that several Lactic Acid Bacteria (LAB) strains isolated from naturally fermented table olives display probiotic potential (Argyri et al. 2013). Amongst them, two strains, namely Lactobacillus pentosus B281 and Lactobacillus plantarum B282 display significant potential for the production of novel probiotic food products (Argyri et al. 2014). The aim of this thesis was to examine the probiotic potential of strains L. pentosus B281 and L. plantarum B282 in novel functional foods and to investigate the molecular and cellular mechanisms of action. The primary purpose of this study was the development of a rapid and effective method for the molecular detection and identification of the above strains. RAPD fingerprinting was firstly applied for the development of strain specific primers as both strains were recently isolated and no sequence data was available. A multiplex PCR assay was designed for each strain, based on specific primers derived from RAPD analysis. The specificity of the assay was successfully tested against different strains of LAB and dairy products prepared in the laboratory. The stains L. pentosus B281 and L. plantarum B282 were originally isolated from olive microbiota and their performance as starters in the fermentation of green olives was evaluated previously (Argyri et al. 2014). Here, their possible use in yogurt production was examined. Cell enumeration and employment of the novel multiplex PCR methodology showed that both strains were presented in yogurt samples at levels ≥ 6 log CFU/g during fermentation and storage. In addition, the microbiological, physicochemical, and sensory profiles of the novel products were similar to the controls, demonstrating the use of the two strains as starter cultures for the production of novel dairy products with probiotic potential. Then, the adhesion properties and the antiproliferative effects of the strains L. pentosus B281 and L. plantarum B282 were investigated. The results demonstrated that both strains exhibited significantly higher adhesion rates to Caco-2 colon cancer cells compared to the probiotic reference strain L. casei ATCC 393. In addition, the conditioned media of the two strains inhibited growth of human colon cancer cells (Caco-2 and HT-29) by promoting a G1-phase arrest and down-regulation of specific cyclin genes. Finally, the bacterial components appeared to be thermostable, as the anti-proliferative activity of heat-treated conditioned media was similar to the non-heat-treated conditioned media in a time- and dose-dependent manner. This data, enhance our understanding of the probiotic role of the two strains and support their application as starter cultures in the production of novel functional food products. The next aim of the project was to characterize the modes of action of the strains L. pentosus B281 and L. plantarum B282 and establish further their probiotic character. For this reason, we investigated the anti-proliferative activity of viable cells on colon cancer cell lines. The results showed that viable cells of the two strains caused a significant reduction in Caco-2 cell proliferation in a time- and dose-dependent manner. Then, employing the air pouch infection system in mice the immunostimulatory activity of the two strains was evaluated. The results demonstrated that both L. pentosus B281 and L. plantarum B282 induced significant recruitment of leukocytes in the air pouch exudates and the release of a range of pro-inflammatory cytokines including interleukin-1α (IL-1α), IL-1β, and IL-6, as well as the chemokines CCL3 and CCL4.

Τα στελέχη Lactobacillus pentosus B281 και Lactobacillus plantarum B282 είναι βακτήρια γαλακτικού οξέος (Lactic Acid Bacteria - LAB), τα οποία απομονώθηκαν από τη μικροχλωρίδα ελιάς και κατέδειξαν προβιοτικές ιδιότητες, όπως είναι η επιβίωση σε προσομοιωμένες συνθήκες του γαστρεντερικού σωλήνα, η αντιμικροβιακή δράση, η ικανότητα προσκόλλησης σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου Caco-2, η αντοχή σε αντιβιοτικά και η αιμολυτική δράση (Argyri et al., 2013). Επιπλέον, οι μικροοργανισμοί L. pentosus B281 και L. plantarum B282, χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά ως εναρκτήριες καλλιέργειες κατά τη ζύμωση πράσινων ελιών (Argyri et al., 2014; Blana et al., 2014), οι οποίες έγιναν αποδεκτές για κατανάλωση, όπως παρουσιάστηκε σε δοκιμές οργανοληπτικής αξιολόγησης (Argyri et al., 2014). Σκοπός στην παρούσα διατριβή, ήταν να εξεταστεί ο προβιοτικός χαρακτήρας των στελεχών L. pentosus B281 και L. plantarum B282 σε νέα λειτουργικά τρόφιμα και να μελετηθούν οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί δράσης τους. Αρχικά για τη μοριακή ανίχνευση και ταυτοποίηση των δύο στελεχών σχεδιάστηκαν εξιδεικευμένοι εκκινητές με RAPD ανάλυση και αναπτύχθηκε μια μέθοδος βασιζόμενη στην τεχνική της Multiplex PCR. Η διακριτική ικανότητα της μεθόδου ελέγχθηκε επιτυχώς έναντι διαφορετικών στελεχών LAB καθώς και σε γαλακτοκομικά προϊόντα που παρασκευάστηκαν στο εργαστήριο. Επιπλέον, τα παραπάνω στελέχη, χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά ως εναρκτήριες καλλιέργειες για την παρασκευή γιαουρτιού όπως έδειξαν οι μικροβιολογικές, φυσικοχημικές και οργανοληπτικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν. Ακόμα, μέσω μικροβιολογικής καταμέτρησης και multiplex PCR ανάλυσης καταδείχτηκε ότι τα στελέχη L. pentosus B281 και L. plantarum B282 επιβίωσαν στα δείγματα γιαουρτιού σε επίπεδα ≥ 6 log CFU/g ακόμη και μετά από 35 ημέρες αποθήκευσης στους 4 °C. Από την διερεύνηση των μηχανισμών δράσης των στελεχών L. pentosus B281 και L. plantarum B282, παρουσιάστηκε αρχικά ότι τα στελέχη παρουσίασαν σημαντική προσκόλληση σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου. Η οπτικοποίηση των κυττάρων που προσκολλώνται στα καρκινικά κύτταρα μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού επιβεβαίωσε περαιτέρω την παραπάνω παρατήρηση. Ακόμη, αποδείχτηκε η αντί-πολλαπλασιαστική δράση του ρυθμιστικού μέσου των παραπάνω στελεχών έναντι διαφορετικών καρκινικών σειρών παχέος εντέρου, ο ρόλος τους στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Επιπροσθέτως, πραγματοποιήθηκε προκαταρτικός χαρακτηρισμός της φύσης των βιοδραστικών μορίων που υπάρχουν στο ρυθμιστικό μέσο των δύο στελεχών και αποδείχτηκε η παρουσία θερμοσταθερών βιοδραστικών ενώσεων. Στη συνέχεια από την διερεύνηση της αντι-πολλαπλασιαστικής και της ανοσοδιεγερτικής δράσης των ζωντανών στελεχών L. pentosus B281 και L. plantarum B282, καταδείχτηκε η αντί-πολλαπλασιαστική δράση τους στην ανθρώπινη καρκινική σειρά παχέος εντέρου Caco-2. Τέλος μέσω του ζωικού μοντέλου του ραχιαίου αεροθύλακα αποδείχτηκε η ανοσοδιεγερτική δράση των παραπάνω στελεχών. Πιο συγκεκριμένα, καταδείχτηκε η στρατολόγηση ουδετερόφιλων και η έκκριση συγκεκριμένων κυτοκινών και χημειοκινών ως ανοσοαπόκριση στη χορήγηση των δύο στελεχών στο ραχιαίο αεροθύλακα ποντικών.