Εφαρμογή νέων βιοτεχνολογικών μεθόδων στην παραγωγή οίνου

Abstract

Malolactic (ML) fermentation is a usual practice in the winemaking industry, as it is known to result in reduced acidity, microbial stabilization, and improvement of sensory characteristics. However, it does not always proceed favorably under the natural conditions of wine. Thus, there is a profound scientific and industrial interest in developing mixed cultures (consisting of yeasts and ML bacteria), capable of conducting simultaneous alcoholic and ML fermentation. Moreover, the use of cell immobilization offers multiple economic and technical advantages like maintenance of cell viability, enhanced fermentation productivity, reduction of operational costs, improvement of product quality, compatibility with various system configurations, etc. Nevertheless, modern industrial and commercial needs require the use of freeze-dried instead of wet cultures, due to the advantages related to longer preservation times, resistance to microbial contamination and easy-handling during storage. In this vein, the rational of the PhD thesis was to assess wet and freeze-dried, free or immobilized kefir culture in simultaneous alcoholic and ML fermentation in wine and cider fermentations to satisfy the industrial and commercial needs. Kefir cells were initially immobilized on natural supports [apple pieces, delignified cellulosic material (DCM), grape skins and zeolites] and their viable counts were determined by microbiological analysis. Noticeably, natural zeolites are known to exhibit many advantages (abundant in nature, easy-to-use, enhanced mechanical strength, no distinctive preparation requirements, etc) and were used for the first time as a carrier for a mixed microbial culture in winemaking. Cell immobilization on natural zeolite surface was also studied by scanning electron microscopy (SEM). The fermentation efficiency of kefir culture was tested in wine and cider repeated batch fermentations at a wide temperature range (5-45 oC). Fermentations were continued for 29 months during winemaking and for a period higher than 7 months during cider-making, showing a high operational stability of all systems used. Remarkably, malic acid conversion up to 71.5 % was recorded and ethanol productivity values [up to 56.9 g/(Ld)], which were considered similar or even higher than in industrial practice were observed, while cider fermentations with immobilized cells on DCM at 37 oC were completed in less than 24 h. Analysis of major volatiles documented an increase of ethyl acetate content and a decrease of higher alcohols at low fermentation temperatures, indicating high quality products. Principal Component Analysis (PCA) on minor volatiles determined by HS-SPME GC/MS analysis revealed that the fermentation temperature rather than the nature of kefir culture had a significant effect during winemaking. On the contrary both the fermentation temperature and the nature of kefir culture (free or immobilized cells) affected the volatile composition during cider-making. Noticeably, all products produced with wet kefir culture were accepted by the panel during the preliminary sensory evaluation.Subsequently, the effect of various cryoprotectants (various concentrations of sugar and glycerol solutions, as well as apple juice) on the fermenting activity of freeze-dried kefir cells in apple juice fermentations at 30 οC was examined. The use of cryoprotectants resulted in no significant improvement on fermentation kinetics, while in some cases cryoprotectant residues were found on the final product. Thus, the operational stability of freeze-dried kefir cells (produced with no cryoprotectants) during cider-making was monitored in repeated batch fermentations at a wide temperature range (5-45 oC). Fermentation kinetics were lower in comparison with wet cell fermentations, though immobilized cells led to improved fermentation activity in most cases, which were accepted by the cider industrial sector. An overall improvement was also observed during the repeated batch fermentations and they continued for a period greater than 5 months. Alcohol content at 5 oC was similar to ciders produced with wet kefir cells (up to 6.6 % vol), while alcohol content at 20, 30 και 37 oC ranged 1.4-5.1 % vol, suggesting the suitability of freeze-dried kefir cells in soft cider-making. The effect of cell immobilization and fermentation temperature on volatiles was also studied. Ester and total volatiles’ concentration was significantly higher in fermentations with freeze-dried immobilized cells on DCM at 20 oC. A decrease in higher alcohols’ content was also obvious following the fermentation temperature reduction, indicating, thus, the high quality of the products. Application of PCA to minor volatiles suggested that both the fermentation temperature and the nature of kefir culture had a significant effect on volatile composition of the produced ciders. Finally, the sensory evaluation ascertained the overall high quality characteristics of the new products.The effect of cell immobilization, use of cryoprotectants during freeze-drying and storage temperature on fermentation efficiency after long-term storage of freeze-dried cells was also investigated. Hence, kefir culture were stored at room (25 oC), refrigerator (4 oC) or freezing temperature (-18 oC) for 1, 3 or 6 months and their activity was monitored in apple juice fermentations at 30 oC. In general, cell immobilization and storage at refrigerator and freezing temperatures had a positive impact on fermentation kinetics. However, all fermentations with freeze-dried cells were completed sooner than the traditional fermentations. Ethanol content and malic conversion ranged in usual values and were not affected by storage duration. On the other hand, the use of cryoprotectants had no significant effect on fermentation times, but affected only specific fermentation kinetics, though not significantly in all cases. Finally, the effect of cell immobilization and repeated batch fermentations on microbial diversity was investigated by PCR-DGGE analysis. Members of the Lactobacillus species (L. helveticus/L. dextrinicus and L. buchneri/L. kefiri/L. sunkii) consisted the predominant bacteria populations, whereas Klyveromyces marxianus/Klyveromyces lactis, and Saccharomyces cerevisiae were the main yeasts identified. No differences were detected at different fermentation temperatures. Kefir culture and cells immobilized on natural zeolites were also analyzed with Next Generation Sequencing (NGS). According to sequencing results, 96 % of reads corresponded to Lactobacillus genus, while Lactobacillus kefiri (95 %) was the predominant species identified. A smaller percentage accounted for other bacteria belonging to Lactobacillus and Lactococcus species (<1 %). On the other hand, eukaryotic population consisted mainly by Kluyveromyces lactis (97 %) και Saccharomyces cerevisiae (2 %) species, though other bacteria and yeast populations were detected in very low percentage (<1 %). Notably, no changes were observed in the microbial composition of kefir culture.In conclusion, wet and/or freeze-dried kefir culture proved suitable for conducting simultaneous alcoholic and malolactic fermentation in a wide temperature range, while no changes were detected in the microbial diversity. Cell immobilization enhanced cell fermentation activity and acted as a protection shield during freeze-drying. The use of low cost and abundant immobilization supports may result in low operational costs, while the absence of cryoprotectants implies even further cost reduction. Finally, the ability to store the freeze-dried cells for a period up to 6 months at various temperatures with no significant effect on fermentation efficiency should be considered as an option between wine- and cider-making seasons.

Η διεξαγωγή μηλογαλακτικής ζύμωσης συνηθίζεται για την παραγωγή οίνων υψηλής και σταθερής ποιότητας και στοχεύει στη μείωση της οξύτητας του τελικού προϊόντος, σε μικροβιακή σταθεροποίηση και σε βελτίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Επειδή, όμως, η επιτυχία της δεν είναι πάντα διασφαλισμένη, τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον για τη χρήση μικτών μικροβιακών καλλιεργειών (αποτελούμενες κυρίως από κατάλληλα στελέχη ζυμομυκήτων και μηλογαλακτικών βακτηρίων) στην οινοποίηση, ικανών να διεξάγουν αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση, αν είναι δυνατόν ταυτόχρονα, είναι έντονο. Επιπλέον, είναι γνωστό πως η χρήση συστημάτων ακινητοποιημένων κυττάρων προσφέρει πολλαπλά τεχνικά και οικονομικά πλεονεκτήματα, όπως κυτταρική προστασία, αύξηση της κυτταρικής βιωσιμότητας και παραγωγικότητας, μείωση του κόστους παραγωγής, βελτίωση της ποιότητας, δυνατότητα χρήσης πολλών τύπων βιοαντιδραστήρων, κλπ, ενώ παράλληλα, οι βιομηχανικές και εμπορικές ανάγκες απαιτούν τη χρήση λυοφιλιωμένων κυττάρων, εξαιτίας κυρίως των ιδιαίτερων τεχνικών πλεονεκτημάτων που εμφανίζουν σε σχέση με τα υγρά κύτταρα (π.χ. υψηλότεροι χρόνοι διατήρησης, προστασία έναντι επιμολύνσεων, ευκολία στη χρήση, κλπ). Συνεπώς, στόχος της Διδακτορικής Διατριβής ήταν η αξιολόγηση υγρών και λυοφιλιωμένων, ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων της καλλιέργειας kefir στην διεξαγωγή αλκοολικής και μηλογαλακτικής ζύμωσης ταυτόχρονα κατά την οινοποίηση και την παραγωγή μηλίτη οίνου.Αρχικά, μελετήθηκε η ακινητοποίηση της καλλιέργειας kefir σε φυσικούς φορείς [κομμάτια μήλου, απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά (DCM), στέμφυλα και κόκκους ζεόλιθου] και προσδιορίστηκαν οι πληθυσμοί των κυττάρων. Σημειώνεται πως οι κόκκοι φυσικού ζεόλιθου χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως φορείς ακινητοποίησης μικτής μικροβιακής καλλιέργειας στην οινοποίηση, λόγω των αυξημένων πλεονεκτημάτων που διαθέτουν (όπως υψηλή διαθεσιμότητα, ευκολία χρήσης, αυξημένη μηχανική αντοχή, απουσία προπαρασκευαστικού σταδίου, κλπ). Επιπλέον, η ακινητοποίηση στην επιφάνεια και στις φυσικές κοιλότητες των κόκκων φυσικού ζεόλιθου μελετήθηκε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM). Για την εκτίμηση της λειτουργικής σταθερότητας, τα κύτταρα δοκιμάστηκαν σε επαναλαμβανόμενες παρτίδες ζύμωσης γλεύκους σταφυλής ή χυμού μήλου σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (5-45 oC). Όλα τα συστήματα έδειξαν αξιοσημείωτη σταθερότητα, αφού οι ζυμώσεις συνεχίστηκαν για διάστημα 29 μηνών και >7 μηνών κατά την παραγωγή οίνου και μηλίτη οίνου, αντίστοιχα. Η μετατροπή του μηλικού οξέος ανήλθε έως 71.5 % και παρατηρήθηκαν τιμές παραγωγικότητας [έως 56.9 g/(Ld)] που είναι ίσες ή/και μεγαλύτερες από αυτές που συνηθίζονται κατά τη βιομηχανική πρακτική, ενώ η παραγωγή μηλίτη οίνου με ακινητοποιημένα κύτταρα σε απολιγνινοποιημένα κυτταρινούχα υλικά στους 37 oC, ολοκληρώθηκε σε <24 h. Από τα κύρια πτητικά παραπροϊόντα που προσδιορίστηκαν, η συγκέντρωση του οξικού αιθυλεστέρα παρουσίασε κατά κύριο λόγο αύξηση στις χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης, ενώ αντίστοιχα η συγκέντρωση των ανώτερων αλκοολών μείωση, γεγονός που σχετίζεται με τη βελτίωση της ποιότητας των προϊόντων που παράχθηκαν. Η εφαρμογή του αλγόριθμου των κυρίων συνιστωσών (PCA) στα πτητικά παραπροϊόντα που ανιχνεύθηκαν μέσω HS-SPME GC/MS ανάλυσης έδειξε ότι, κατά την οινοποίηση, η σύστασή τους επηρεάστηκε περισσότερο από τη θερμοκρασία της ζύμωσης, ενώ αντίθετα κατά την παραγωγή μηλίτη οίνου τόσο η θερμοκρασία της ζύμωσης όσο και η φύση της καλλιέργειας kefir (ελεύθερα ή ακινητοποιημένα κύτταρα) επηρέασαν σημαντικά το προφίλ των υπεύθυνων για το άρωμα ενώσεων. Όλα τα προϊόντα που παράχθηκαν από τις επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις με υγρά κύτταρα καλλιέργειας kefir έγιναν αποδεκτά κατά τον προκαταρκτικό οργανοληπτικό έλεγχο επιβεβαιώνοντας την υψηλή τους ποιότητα.Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λυοφιλίωση και εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων κρυοπροστατευτικών μέσων (σακχάρων και γλυκερόλης σε διάφορες συγκεντρώσεις και χυμού μήλου) στη ζυμωτική ικανότητα των ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων της καλλιέργειας kefir με ζυμώσεις χυμού μήλου στους 30 oC. Η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων δεν αποδείχθηκε ικανή να βελτιώσει σημαντικά τις κινητικές παραμέτρους των ζυμώσεων, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε μεταφορά υπολειμμάτων στο τελικό προϊόν. Επομένως, σε επόμενο στάδιο αξιολογήθηκε η λειτουργική σταθερότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων που παράχθηκαν χωρίς κρυοπροστατευτικά μέσα, μέσω επαναλαμβανόμενων ζυμώσεων μηλίτη οίνου σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών (5-45 oC). Οι κινητικές παράμετροι κυμάνθηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τις αντίστοιχες τιμές των ζυμώσεων με υγρά κύτταρα, αλλά η ακινητοποίηση οδήγησε σε σημαντική βελτίωση στην πλειοψηφία των ζυμώσεων, ενώ κυμάνθηκαν σε επίπεδα αποδεκτά από τη βιομηχανία. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε βελτίωση κατά το πέρας των επαναλαμβανόμενων παρτίδων ζύμωσης, υποδεικνύοντας τη λειτουργική σταθερότητα των συστημάτων για διάστημα >5 μηνών. Στις ζυμώσεις στους 5 oC παράχθηκε μηλίτης οίνος με συγκέντρωση αλκοόλης όμοια με τις ζυμώσεις υγρών κυττάρων (έως 6.6 % vol), ενώ στις ζυμώσεις στους 20, 30 και 37 oC η συγκέντρωση της αλκοόλης κυμάνθηκε σε εύρος 1.4-5.1 % vol, υποδηλώνοντας την καταλληλότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων για την παραγωγή μηλίτη οίνου χαμηλότερου αλκοολικού βαθμού. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης και της θερμοκρασίας ζύμωσης στα πτητικά παραπροϊόντα. Η συγκέντρωση εστέρων και συνολικών πτητικών παραπροϊόντων ήταν σημαντικά αυξημένη στις ζυμώσεις με λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα σε DCM στους 20 oC, ενώ παρατηρήθηκε προοδευτική μείωση της συγκέντρωσης των ανώτερων αλκοολών παράλληλα με τη μείωση της θερμοκρασίας ζύμωσης, γεγονός σημαντικό για την ποιότητα του μηλίτη οίνου. Ο αλγόριθμος των κυρίων συνιστωσών (PCA) που εφαρμόστηκε στα πτητικά παραπροϊόντα που ανιχνεύθηκαν μέσω HS-SPME GC/MS έδειξε ότι τόσο η θερμοκρασία της ζύμωσης όσο και η φύση της καλλιέργειας kefir (ελεύθερα ή ακινητοποιημένα κύτταρα) επηρέασαν σημαντικά τη σύσταση των πτητικών παραπροϊόντων. Όλα τα προϊόντα που παράχθηκαν από επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις με λυοφιλιωμένα κύτταρα καλλιέργειας kefir έγιναν αποδεκτά κατά τον προκαταρκτικό οργανοληπτικό έλεγχο.Έπειτα, μελετήθηκε η επίδραση των κρυοπροστατευτικών μέσων, της ακινητοποίησης και της θερμοκρασίας κατά την αποθήκευση για μεγάλο χρονικό διάστημα στη ζυμωτική ικανότητα των λυοφιλιωμένων κυττάρων. Μετά τη λυοφιλίωση, τα κύτταρα αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασίες δωματίου (25 oC), ψυγείου (4 oC) ή κατάψυξης (-18 oC) για διάστημα 1, 3 ή 6 μηνών και αξιολογήθηκαν σε ζυμώσεις χυμού μήλου στους 30 oC. Σε γενικές γραμμές, η ακινητοποίηση και η αποθήκευση σε θερμοκρασίες ψυγείου και κατάψυξης είχαν κατά μέσο όρο σημαντικά θετική επίδραση στις κινητικές παραμέτρους. Αξίζει, ωστόσο, να σημειωθεί πως όλες οι ζυμώσεις ολοκληρώθηκαν σε διάστημα μικρότερο από αυτό που απαιτείται στην περίπτωση μιας παραδοσιακής ζύμωσης. Επιπλέον, η συγκέντρωση της αιθανόλης και η μετατροπή του μηλικού οξέος κυμάνθηκαν σε αποδεκτές τιμές και δεν επηρεάστηκαν από το διάστημα της αποθήκευσης. Η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων, αντίθετα, δεν επηρέασε σημαντικά τους χρόνους ζύμωσης, παρά μόνο μεμονωμένες κινητικές παραμέτρους, χωρίς η διαφορά να είναι πάντα στατιστικά σημαντική. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης και των επαναλαμβανόμενων ζυμώσεων στην μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας kefir και οι πιθανές αλλαγές προσδιορίστηκαν με PCR-DGGE. Οι κυρίαρχοι βακτηριακοί πληθυσμοί που ανιχνεύθηκαν ήταν μέλη του γένους Lactobacillus (L. helveticus/L. dextrinicus/L. buchneri/L. kefiri/L. sunkii), ενώ οι Klyveromyces marxianus/Klyveromyces lactis και Saccharomyces cerevisiae αποτέλεσαν τα κύρια μέλη της χλωρίδας των ζυμομυκήτων. Αξίζει να σημειωθεί πως δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στη μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας κατά τις επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις σε διάφορες θερμοκρασίες. Επιπλέον, η σύσταση της καλλιέργειας kefir και των ακινητοποιημένων κυττάρων σε κόκκους φυσικού ζεόλιθου μελετήθηκε μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, το 96 % των αλληλουχιών που ανιχνεύθηκαν ανήκε στο γένος Lactobacillus και το κυρίαρχο είδος ήταν o Lactobacillus kefiri (95 %), ενώ ένα μικρό ποσοστό αντιστοιχούσε σε βακτήρια του γένους Lactobacillus και Lactococcus (<1 %). Όσο αφορά τον πληθυσμό των ευκαρυωτών, κατά κύριο λόγο αποτελούνταν από Kluyveromyces lactis (97 %) και Saccharomyces cerevisiae (2 %). Όμως, εντοπίστηκαν πληθυσμοί άλλων βακτηρίων και ζυμομυκήτων σε πολύ μικρό ποσοστό (<1 %), ενώ δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές στη μικροβιακή σύσταση της καλλιέργειας.Συμπερασματικά, η καλλιέργεια kefir αποδείχθηκε κατάλληλη για διεξαγωγή αλκοολικής και μηλογαλακτικής ζύμωσης ταυτόχρονα, τόσο στην υγρή όσο και στη λυοφιλιωμένη της μορφή, σε μεγάλο εύρος θερμοκρασιών, χωρίς να παρατηρηθούν μεταβολές στη σύστασή της. Η ακινητοποίηση ενίσχυσε τη ζυμωτική δραστηριότητα των κυττάρων και έδρασε προστατευτικά κατά τη λυοφιλίωση. Η χρήση φθηνών υλικών με υψηλή καθαρότητα και διαθεσιμότητα ως φορείς ακινητοποίησης συνεπάγεται χαμηλό λειτουργικό κόστος της προτεινόμενης τεχνολογίας. Επιπλέον, η χρήση κρυοπροστατευτικών μέσων κατά τη λυοφιλίωση κρίθηκε μη απαραίτητη, γεγονός που οδηγεί σε περαιτέρω μείωση του λειτουργικού κόστους. Τέλος, η διατήρηση της ζυμωτικής ικανότητας των λυοφιλιωμένων κυττάρων μετά από αποθήκευση για διάστημα έως 6 μηνών σε διάφορες θερμοκρασίες φαίνεται να αποτελεί λύση συντήρησης των καλλιεργειών στο μεσοδιάστημα μεταξύ των οινοπαραγωγικών περιόδων.