Στοιχεία του μικροπεριβάλλοντος στον καρκίνο του μαστού ως προγνωστικός δείκτης

Abstract

Background: Tumors and their surrounding area represent spatially organized “ecosystems”, where tumor cells and the immune contextures of the different compartments are in a dynamic interplay. Tumor immune-cell infiltration is progressively becoming an important aspect for tumor characterization and clinical outcome prediction of cancer patients. Little has been done to evaluate the importance of diverse compartmental immune cell distribution in breast cancer (BCa) nor to assess the presence and number of Tertirary Lymphoid Structures that may surround each tumor. The latter are lymph-node-like structures sharing architectural and functional characteristics with secondary lymphoid organs and are often detected in the tumor microenvironment. Their presence has been associated with controversial clinical outcomes. The scope of this thesis is to clarify their relation with prognosis in BCa patients alone and in combination with tumoral immune infiltrates. Methods: Formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue samples from 167 BCa patients, with invasive ductal, non-metastatic BCa, not treated with neoadjuvant chemotherapy, have been used to detect and quantify the presence immune cell infiltrates in the diverse tumor compartments (Tumor center-TC,Infiltrative margin -IM). Tumor tissue was stained with (CD4,CD8,CD163,FoxP3) immunostains and photographed in multiple locations inside the tumor center and along its infiltrative margin. TLS assessment was also performed. The latter were identified morphologically as ovoid lymphocytic aggregates presenting a germinal center and/or high endothelial venules. Subsequently those were counted and furthermore characterized as adjacent(aTLS, within the tumor IM) or as distal (dTLS,≤5mm from the IM within the non-neoplastic tissue). Clinical follow-up was available for 112 of these patients. The cellular densities of CD8+ and CD163+ were calculated by means of immunohistochemical stains, microphotographs and image analysis software (ImageJ - particle analysis). The presence and number of TLS was performed mainly in H&E slides with the occasional auxiliary use of immunohistochemical stains in ambiguous cases. Statistical analysis was performed with IBM SPSS Statistics 24. Results: The results indicated that the combined assessment of CD8+ and CD163+ immune cell densities infiltrating diverse tumor compartments (TC and IM) may enhance the prognostic accuracy of disease progress (DFS and OS). The presence of increased CD8+ cellular densities inside the tumor center and decreased along the infiltrative border and/or the decreased cellular densities of CD163+ in tumor center and increased in periphery seem to be related with favorable prognosis whilst the opposite immune cell distributions with unfavorable prognosis. Regarding the assessment of peritumoral TLS, their absence was associated with longer DFS and OS. Moreover, not only the presence of peritumoral TLS, but also their density has been proven to be prognostically crucial, since patients with numerous peritumoral TLS exhibited worst DFS and OS. By combining quantitative peritumoral TLS measurements with the differential combined immunological cellular densities of CD8+ and CD163+ in the diverse cellular compartments (TC and IM), two immunological signatures with reinforced prognostic significance (RFCIS&RUCIS) were created which offered increased prognostic significance. Conclusions: The results of the current thesis demonstrate for the first time an association between spatial differential densities of intratumoral immune infiltrates with peritumoral TLS and clinical outcomes which seems to influence DFS and OS. The observations further support the existence and importance of a dynamic interplay between the immune cells within the tumor microenvironment (TC,IM) and its surrounding counterpart (TLS).

ΣΚΟΠΟΣ: Οι νεοπλασματικοί όγκοι και το μικροπεριβάλλον τους αντιπροσωπεύουν οργανωμένα «οικοσυστήματα», όπου κύτταρα του όγκου και του ανοσοποιητικού συστήματος των διαφορετικών χωροταξικών διαμερισμάτων (κέντρο όγκου - ΤC & διηθητικό μέτωπο - ΙΜ) βρίσκονται σε δυναμική αλληλεπίδραση που είναι καθοριστική για την εξέλιξή του και την κλινική έκβαση των ασθενών. Στον καρκίνο του μαστού έχουν πλημμελώς μελετηθεί η χωροταξική κατανομή των διαφόρων ανοσολογικών κυττάρων και η σημασία της παρουσίας και του αριθμού των περινεοπλασματικών Τριτογενών Λεμφοειδών Δομών σε σχέση με την πρόοδο της νόσου. Οι τελευταίες δομές, ορίζονται ως λεμφοειδείς αθροίσεις με μορφολογικά και ανοσοϊστοχημικά χαρακτηριστικά Δευτερογενών Λεμφοειδών Οργάνων. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της προγνωστικής σημασίας των κυτταρικών πυκνοτήτων των CD8+ και CD163+ ανοσολογικών κυττάρων στα διαμερίσματα του όγκου αλλά και των περινεοπλασματικών TLS, είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με τα παραπάνω. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Κατά την ιστολογική αξιολόγηση 167 ασθενών με επιβεβαιωμένο διηθητικό ΒCa, πραγματοποιήθηκαν ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με (CD4, CD8, CD163, FoxP3) σε κεντρική τομή του όγκου και ελήφθησαν μικροφωτογραφίες από το κέντρο και το διηθητικό μέτωπο του όγκου από κάθε ανοσοϊστοχημικώς κεχρωσμένο πλακίδιο. Επίσης πραγματοποιήθηκε η καταμέτρηση των TLS κατά την περιφέρεια των νεοπλασματικών όγκων (σε απόσταση έως 5 χιλιοστά από το IM). Η κλινική παρακολούθηση ήταν διαθέσιμη για 112 από τους ασθενείς αυτούς. Η κυτταρική πυκνότητα των CD8+ και CD163+ υπολογίστηκε με τη βοήθεια ανοσοϊστοχημικού ελέγχου, μικροφωτογραφιών και λογισμικού (parcticle analysis του ImageJ). Η παρουσία και ο αριθμός των TLS στις τομές A&H με επικουρική χρήση ανοσοϊστοχημείας στις αμφίσημες περιπτώσεις. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το IBM SPSS Statistics 24. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα αποτελέσματα των μετρήσεων υπέδειξαν πως η συνδυασμένη αξιολόγηση των κυτταρικών πυκνοτήτων των CD8+ και CD163+ ανοσολογικών κυττάρων που διηθούν τα διαμερίσματα του όγκου (TC και IM) μπορούν να βελτιώσουν την ακρίβεια της πρόβλεψης στην πρόοδο της νόσου (OS και DFS). Η παρουσία CD8+ αυξημένων κυτταρικών πυκνοτήτων στο κέντρο του όγκου και μειωμένων στο διηθητικό μέτωπο ή/και χαμηλών CD163+ συγκεντρώσεων στο κέντρο του όγκου και υψηλών στο κυτταρικό μέτωπο σχετίζονται με ευνοϊκή πρόγνωση ενώ, μια αντίστροφη ανοσολογική κυτταρική κατανομή με δυσμενή. Όσον αφορά την παρουσία και τον αριθμό των περινεοπλασματικών TLS η απουσία των τελευταίων συσχετίστηκε με μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερου νόσου (DFS) και συνολικής επιβίωσης (OS) σε σχέση με ασθενείς στους οποίους ανευρέθηκαν TLS, και αυτή η αρνητική συσχέτιση παρατηρείται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Επιπρόσθετα, πέραν της παρουσίας, πολύ σημαντικός είναι κι ο αριθμός των ΤLS για την πρόγνωση δεδομένου ότι οι ασθενείς με περισσότερα TLS παρουσίασαν δυσμενέστερη πρόγνωση. Συνδυάζοντας τις ποσοτικές μετρήσεις των TLS με τις ανοσολογικές υπογραφές (όπως αυτές προέκυψαν από την κατανομή των CD8+ & CD163+ υποπληθυσμών στο ΤC και στο ΙΜ) δημιουργήθηκαν δυο συνδυαστικές ανοσολογικές υπογραφές με βελτιωμένη προγνωστική αξία. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα αποτελέσματα που απορρέουν από αυτήν τη διατριβή επιβεβαιώνουν την ύπαρξη μιας δυναμικής αλληλεπίδρασης ανάμεσα στους ανοσολογικούς κυτταρικούς υποπληθυσμούς (CD8+ και CD163+) των διαφορετικών διαμερισμάτων του όγκου και των περινεοπλασματικών - TLS, η οποία φαίνεται να επηρεάζει την κλινική έκβαση ασθενών με ΒCa.