Χαρακτηρισμός προτύπων δράσης μικρών RNA στην αρσενική γαμετική σειρά της Drosophila melanogaster

Abstract

miRNAs are small regulatory RNA molecules that bind to partially complementary sequences at the 3'UTR of mRNAs and impair their translation. It has recently been reported that key-factors of miRNA biogenesis are involved in the control of germ stem cell division and maintenance in Drosophila melanogaster. Initially, this study provides in-vivo experimental evidence for the negative post-transcriptional regulation of gene CG10222 in Drosophila by miR-13 through the 3'UTR sequence. "Sensor" transgenic lines were therefore produced and analyzed, where the reporter gene EGFP was fused to the wild type or appropriately mutated versions of CG10222-3'UTR. EGFP expression in third instar larvae remained low in the presence of the wild type CG 10222-3'UTR, while it was restored to normal levels when the binding site for miR-13 was mutated. Based on the response of EGFP/CG70222-3'UTR towards miR-13, sensor lines became a valuable tool in investigating the miRNA activity pattern in the male germ line. Through the analysis of EGFP expression in testes taken from third instar larvae and adult individuals, it was observed that miR-13 was highly active only in the early pre-meiotic sperm progenitor cells. As spermatogenesis reached the spermatocyte growth stage, miR-13 activity gradually disappeared. The same activity pattern was revealed after analyzing sensor lines for other miRNA implying that all germ line expressed miRNA exhibit this general activity profile. The detection of the expression pattern for one member of the miR-2/miR-13 subfamily revealed that it was further produced in late pro-meiotic spermatocyte populations, where it was no longer active. This observation suggested the presence of an active mechanism that intercepted miRNA activity during the spermatocyte growth period. When the sensor lines were tested under spermatocyte arrest (sa) and off-schedule (ofs) mutant backgrounds, the reporter exhibited silencing in all cell types. The combined findings of this study lead to a model where miRNAs are expressed and act in the early sperm progenitor cells. As germ line differentiation proceeds through the spermatocyte growth period, sa and ofs genes gradually block miRNA activity until the point where miRNA expression ceases.

Τα miRNA είναι μικρά ρυθμιστικά RNA μόρια που προσδένονται σε μερικώς συμπληρωματικές αλληλουχίες του 3'UTR των mRNA και παρεμποδίζουν την μετάφρασή τους. Πρόσφατες εργασίες εμπλέκουν βασικούς παράγοντες της βιογένεσης των miRNA στη ρύθμιση της διαίρεσης και την διατήρηση της ταυτότητας των αρχέγονων γαμετικών κυττάρων στην Drosophila melanogaster. Στην παρούσα εργασία αρχικά παρουσιάζεται η in-vivo πειραματική απόδειξη της αρνητικής μεταμεταγραφικής ρύθμισης που επιβάλλει το miR-13 στο γονίδιο CG10222 μέσω του 3'UTR του, στην Drosophila. Για τον σκοπό αυτό παρήχθησαν και αναλύθηκαν διαγονιδιακές σειρές «αισθητήρες» στις οποίες το γονίδιο ανταποκριτής EGFP συνδέθηκε με το αγρίου τύπου CG10222-3'UTR ή με κατάλληλα τροποποιημένες παραλλαγές του. Η έκφραση της EGFP σε προνύμφες τρίτου σταδίου παρέμεινε χαμηλή παρουσία του αγρίου τύπου CG 10222-3'UTR, ενώ αντίθετα ανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα όταν το σημείο πρόσδεσης για το miR-13 είχε αλλοιωθεί. Με οδηγό την απόκριση της χίμαιρας EGFP/CG10222-3'UTR απέναντι στο miR-13 οι σειρές αισθητήρες αποτέλεσαν ένα βασικό εργαλείο για τη μελέτη του προτύπου ενεργότητας των miRNA στην αρσενική γαμετική σειρά. Η ανάλυση της έκφρασης της EGFP σε όρχεις από προνύμφες τρίτου σταδίου και ενήλικα άτομα αποκάλυψε υψηλή miR-13 ενεργότητα στα πρώιμα προ-μειωτικά γαμετικά κύτταρα. Κατά την ωρίμανση των σπερματοκυττάρων, πριν την είσοδο τους στην μείωση, η ενεργότητα του miR-13 σταδιακά αναιρέθηκε. Το ίδιο πρότυπο ενεργότητας καταγράφηκε κατά την ανάλυση σειρών αισθητήρων και για άλλα miRNA προτείνοντας την γενίκευση των παρατηρήσεων για όλα τα γαμετικά εκφραζόμενα miRNA. Η ανίχνευση του προτύπου έκφρασης ενός miRNA από την υποοικογένεια miR-2/miR-13 έδειξε ότι παράγονταν και σε ωριμότερους πληθυσμούς προ-μειωτικών σπερματοκυττάρων όπου δεν ήταν πλέον ενεργό. Βάση αυτής της παρατήρησης δημιουργήθηκαν ενδείξεις για την ύπαρξη ενός ενεργού μηχανισμού αναχαίτισης της δράσης των miRNA κατά την περίοδο ωρίμανσης των σπερματοκυττάρων. Η miRNA-ελεγχόμενη σίγηση του ανταποκριτή έγινε καθολική όταν οι σειρές αισθητήρες συνδυάστηκαν γενετικά με τα μεταλλάγματα των spermatocyte arrest, sa και off-schedule, ofs. Η συσχέτιση των ευρημάτων της παρούσας εργασίας οδηγεί σε ένα μοντέλο κατά το οποίο τα miRNA εκφράζονται και δρουν στα πρώιμα γαμετικά κύτταρα της αρσενικής σειράς. Κατά την πρόοδο της σπερματογένεσης, στο στάδιο των ωριμαζόντων σπερματοκυττάρων, τα γονίδια sa και ofs ακυρώνουν την δράση των miRNA μέχρι που τα miRNA παύουν να παράγονται.