Μελέτη της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης των καλλικρεϊνών και της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης, μέσω των μορίων microRNA, στον καρκίνο του μαστού: αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής, προβλεπτικής και προγνωστικής αξίας

Abstract

Aim of the study: The expression analysis and clinical evaluation of KLK8 and DDC, as well as the microRNA molecules which target the genes of interest, miR-224 and miR-145. Materials and Methods: Breast tissues (cancerous and non-cancerous, N=250) were homogenized and total RNA was extracted, polyadenylated (for miRNA analyses) and reverse transcribed into cDNA. Using different miRNA target prediction algorithms, we selected for further analysis two miRNAs, miR-224 and miR-145. Thereafter, KLK8, DDC and miR-224 and miR-145 expression levels, were quantified using Real-Time PCR. The clinical evaluation of the prognostic and the differential diagnostic potential of the biomolecules under study, was accomplished by using extensive biostatistical analyses. Results – Conclusion: Multivariate analysis showed that KLK8 expression is a strong and independent predictor of adverse DFS in breast cancer (HR=4.54, P=0.004). DDC mRNA levels were increased in a statistically significant degree in Ki67 positive (P=0.023) and high histological grade breast tumors (P=0.020). DDC mRNA expression was identified as strong independent indicator of unfavorable outcome with regard to DFS, for breast cancer patients (HR=3.82, P=0.033). In the case of miR-224, we observed that high-levels of miR-224 expression, is also a significant unfavorable prognostic marker independent of other clinicopathological factors (HR=4.86, P=0.014). miR-145, was found to be lower in high histological grade breast tumors (P<0.001) and in Ki67 positive ones (P<0.001). It is worth mentioning here, that DDC expression profile was the exact opposite in breast tumors with these clinicopathological features. In conclusion, the biomolecules under study, represent promising molecular indicators that could aid in the differential diagnosis and provide accurate prognostic information for breast cancer patients.

Σκοπός: Η μελέτη και η κλινική αξιολόγηση, των γονιδίων των καλλικρεϊνών (KLK8), της L-DOPA αποκαρβοξυλάσης (DDC), καθώς και των μορίων miRNAs που συμμετέχουν στην ρύθμιση της έκφρασής τους, στον καρκίνο του μαστού. Μεθοδολογία: Πραγματοποιήθηκε ομογενοποίηση καρκινικών και μη καρκινικών ιστολογικών δειγμάτων μαστού (N=250), απομόνωση ολικού RNA, πολυαδενυλίωση (για την ανάλυση των miRNAs), και αντίστροφη μεταγραφή σε συμπληρωματικό DNA (cDNA). Ακολούθως, με τη χρήση ειδικών αλγορίθμων βιοπληροφορικής, επιλέχθηκαν προς μελέτη τα miRNAs, miR-224 και miR-145, που προβλέπεται ότι στοχεύουν τα γονίδια των KLKs και της DDC, αντίστοιχα. Έγινε σχεδιασμός, ανάπτυξη και έλεγχος της ποιότητας μεθόδου ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο, με τη χρήση του συστήματος ανίχνευσης της χρωστικής SYBR Green Ι, για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων KLK8, και της DDC και των μορίων miR-224 και miR-145. Πραγματοποιήθηκε εκτενής βιοστατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση της διαγνωστικής και προγνωστικής αξίας των μελετώμενων βιομορίων, στον καρκίνο του μαστού. Αποτελέσματα – Συμπεράσματα: Η έκφραση του γονιδίου KLK8, βρέθηκε να αποτελεί ένα νέο και ανεξάρτητο δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού (HR=4.54, P=0.004). Τα επίπεδα έκφρασης του DDC, βρέθηκαν να είναι αυξημένα σε όγκους μαστού θετικούς για την έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 (P=0.023), και με υψηλό βαθμό ιστολογικής κακοήθειας (P=0.020) καθώς και να αποτελεί ένα νέο βιοδείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τους ασθενείς με τη νόσο (HR=3.82, P=0.033). Όσον αφορά το miR-224, τα επίπεδα έκφρασής του βρέθηκαν να είναι σημαντικά αυξημένα σε τριπλά αρνητικά καρκινώματα μαστού. Η αξία του miR-224, ως μοριακού δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης για τον καρκίνο του μαστού, επιβεβαιώθηκε και με την πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox (HR=4.86, P=0.014). Τα επίπεδα έκφρασης του miR-145, βρέθηκαν να μειώνονται σε όγκους μαστού υψηλού βαθμού ιστολογικής κακοήθειας (P<0.001) και θετικούς για την έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 (P<0.001). Το πρότυπο έκφρασής του φαίνεται να είναι το αντίστροφο από αυτό που παρατηρήθηκε για το γονίδιο DDC, στα καρκινικά δείγματα μαστού. Τα μελετώμενα βιομόρια θα μπορούσαν να ενισχύσουν την έγκυρη πρόγνωση και να συμβάλουν στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο του μαστού.