Φαινοτυπικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μικρομεταστατικών κυττάρων ασθενών με καρκίνο του μαστού

Abstract

The detection of circulating tumor cells (CTCs) in the peripheral blood of breast cancer patients is an independent marker for lower response rates to chemotherapy, increased risk of relapse and reduced overall survival. The phenotypic characterization of CTCs might further help to identify subgroups of patients with poor prognosis, which could be offered targeted therapies against molecules expressed on CTCs. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and the generation of cancer stem cells (CSCs) are two biological processes involved in metastasis formation and strongly associated with resistance to conventional therapies and worse clinical outcome.On this basis, we developed a novel triple immunofluorescence methodology in order to investigate the co-expression of ALDH1 and TWIST, as putative CSC and EMT markers, respectively, on single CTCs of patients with breast cancer, using the semi-automated fluorescence microscopy system ARIOL. High ALDH1 expression levels and nuclear TWIST localization were defined as CSC and EMT phenotypes, respectively. These characteristics were first evaluated on CTCs from 80 patients with early and 50 with metastatic breast cancer. CTCs bearing both the CSC and partial EMT phenotypes were more frequently detected in metastatic disease, in contrast to the early disease setting wherein CTCs with a non-stem cell, epithelial phenotype (ALDH1low/neg /TWISTcyt/neg) were mainly identified. We next applied the current methodology to 154 metastatic breast cancer patients before and after first-line chemotherapy, showing that even though treatment reduced or eliminated CTCs in the majority of patients, CTCs co-expressing the CSC and EMT phenotypes were significantly enriched after treatment. The presence of CTCs was correlated with disease progression and lower rates of 2-year survival, whereas the detection of CTCs bearing CSC and EMT phenotypes was correlated to metastases in specific organs such as bones and lung. Moreover, chemotherapy significantly increased CTCs co-expressing the two phenotypes exclusively among patients who progressed at the end of treatment, however the prognostic value of this CTC subpopulation merits further investigation. Finally, we investigated whether the above CSC-like CTCs also acquire functional stem cell characteristics, as defined by the high enzymatic activity of ALDH, by the ALDEFLUOR assay using flow cytometry. The evaluation of CTCs from 9 breast cancer patients showed a significant correlation between CTCs bearing high ALDH activity and high ALDH1 expression.To summarize, we provided a new methodology for the detection of CSC and EMT markers on single CTCs of breast cancer patients. We showed that CTCs co-expressing these features were selected during disease progression and after chemotherapy administration. These findings provide evidence that CTCs acquiring CSC and partial EMT characteristics consist an aggressive CTC population, which might be involved in metastatic breast cancer progression and exhibit increased chemo-resistance. We finally showed that the current methodology identified an active CTC population with functional CSC characteristics.

H παρουσία κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ) στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού αποτελεί ισχυρό δείκτη μειωμένης ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία, αυξημένης πιθανότητας υποτροπής και μειωμένης ολικής επιβίωσης. Ο περαιτέρω φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ είναι δυνατόν να ταυτοποιήσει υποομάδες ασθενών με φτωχή πρόγνωση, οι οποίοι θα μπορούσαν να επωφεληθούν από στοχεύουσες θεραπείες έναντι μορίων-στόχων στα ίδια τα ΚΚΚ. Η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΜ) των καρκινικών κυττάρων και η γένεση καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΒΚ) αποτελούν βιολογικές διαδικασίες με σημαντικό ρόλο στη μεταστατική διαδικασία και σχετίζονται άμεσα με αντίσταση στη θεραπεία και χειρότερη κλινική έκβαση.Με βάση τα παραπάνω, αναπτύχθηκε μία νέα μεθοδολογία τριπλού ανοσοφθορισμού για τον έλεγχο της συνέκφρασης της ALDH1 και του TWIST, ως δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ, αντίστοιχα, στα ΚΚΚ ασθενών με καρκίνο μαστού, μέσω του συστήματος μικροσκοπίας ARIOL. Ως φαινότυποι ΚΒΚ και ΕΜΜ ορίστηκαν η υψηλή έκφραση ALDH1 και η πυρηνική εντόπιση TWIST, αντιστοίχως. Η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόστηκε στα ΚΚΚ 80 ασθενών με πρώιμο και 50 με μεταστατικό καρκίνο μαστού, όπου διαπιστώθηκε ότι ΚΚΚ με σύγχρονη έκφραση των φαινότυπων ΚΒΚ και ΕΜΜ (ALDH1high/TWISTnuc) ανιχνεύτηκαν κυρίως στη μεταστατική νόσο, σε αντίθεση με τους ασθενείς πρώιμου σταδίου, οι οποίοι εμφάνισαν κυρίως ΚΚΚ μη-βλαστικού επιθηλιακού φαινότυπου (ALDH1low/neg/TWISTcyt/neg). Ακολούθως, η παραπάνω μεθοδολογία εφαρμόσθηκε σε δείγμα 154 ασθενών με μεταστατική νόσο πριν και μετά τη χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής. Στην πλειοψηφία των ασθενών η θεραπεία είτε μείωσε είτε εξαφάνισε τα ΚΚΚ, εντούτοις οδήγησε παράλληλα σε σημαντική αύξηση των ΚΚΚ με χαρακτήρες ΚΒΚ και ΕΜΜ. Επίσης, η παρουσία των ΚΚΚ συσχετίστηκε με πρόοδο νόσου στο τέλος της χημειοθεραπείας και συνολική επιβίωση μικρότερη της διετίας, ενώ η παρουσία ΚΚΚ με φαινότυπους ΚΒΚ και ΕΜΜ συσχετίστηκε με την παρουσία μεταστάσεων σε συγκεκριμένα όργανα, όπως τα οστά και τους πνεύμονες. Επιπλέον, η χημειοθεραπεία οδήγησε σε σημαντική αύξηση των ΚΚΚ με χαρακτήρα ΚΒΚ και ΕΜΜ αποκλειστικά στους ασθενείς που σημείωσαν πρόοδο νόσου, εντούτοις η προγνωστική αξία του συγκεκριμένου κυτταρικού υποπληθυσμού χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Τέλος, διερευνήθηκε εάν τα ΚΚΚ που φέρουν το φαινότυπο ΚΒΚ εμφανίζουν και λειτουργικό χαρακτήρα ΚΒΚ, ο οποίος ορίστηκε βάσει της υψηλής ενεργότητας του ενζύμου ALDH μέσω της δοκιμής ALDEFLUOR και της κυτταρομετρίας ροής. Από τη μελέτη των ΚΚΚ ενδεικτικά σε 9 ασθενείς με μεταστατική νόσο, προέκυψε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των ΚΚΚ με υψηλή έκφραση ALDH1 και υψηλή ενεργότητα ALDH.Επομένως, η παρούσα μελέτη προσέφερε μία νέα μεθοδολογία για το χαρακτηρισμό των ΚΚΚ ως προς τη συνέκφραση σημαντικών δεικτών ΚΒΚ και ΕΜΜ. Τα ΚΚΚ με σύγχρονη έκφραση των δύο φαινότυπων επιλέχθηκαν κατά την εξέλιξη της νόσου και έπειτα από τη χορήγηση χημειοθεραπείας, υποδεικνύοντας ότι ο συγκεκριμένος υποπληθυσμός συμμετέχει στη μεταστατική διαδικασία και εμφανίζει αυξημένη χημειο-αντίσταση. Τέλος, δείχθηκε ότι η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε μέσω του ARIOL ταυτοποιεί έναν πράγματι ενεργό υποπληθυσμό ΚΚΚ με λειτουργικά χαρακτηριστικά ΚΒΚ.