Σύσταση, δομή και οικοφυσιολογικός ρόλος μικροοργανισμικών κοινοτήτων στον πεπτικό σωλήνα εκτρεφόμενων ιχθύων

Abstract

Studies have shown that host, diet and habitat can affect fish gut bacterial diversity, but even under the same environmental conditions, significant differences may occur. Up-to-date studies on fish bacterial symbionts are related to the effect of diet on the structure of these bacterial communities. This thesis studied for the first time the autochthonous gut bacterial diversity of Sparus aurata and Dicentrarchus labrax individuals originating from five distantly located aquaculture installations in Greece, in order to determine the impact of geographic location and to reveal their core gut microbiota.Moreover, we assessed whether five fish (Sparus aurata, Dicentrarchus labrax, Diplodus puntazzo, Pagrus pagrus, Argyrosomous regius) species cultured on the same site and fed with isoenergetic and isoproteic diets differ in their gut bacterial communities. Finally, we also investigated the host-associated bacterial succession during the early embryonic stages and first feeding in farmed Sparus aurata and Salmo salar populations.We analyzed the 16S rRNA gene diversity of Bacteria, targeting the V3-V4 region by using next generation sequencing techniques (454 pyrosequencing, illumina). Data analyses resulted in no significant geographic impact in the gut bacterial communities within the two allopatric host species (S. aurata, D. labrax), while strong similarities between them were also present. Our survey revealed the existence of a core gut microbiota within and between them independent of diet and geographic location consisting of the Delftia, Pseudomonas, Pelomonas, Propionibacterium, and Atopostipes genera.Results also revealed that the OTUs richness between the five sympatric host species (S. aurata, D. labrax, D. puntazzo, P. pagrus, A. regius) did not vary significant, but only 4% of the found OTUs belong to the core gut microbiota, indicating selective pressure within the gut, favoring the establishment and development of specific bacterial species in the gastrointestinal system in each of the five fish species. Results regarding the host associated bacterial succession in S. aurata and S. salar larviculture showed significantly higher species richness in rearing water samples. OTUs were shared between larvae and environmental samples (rearing water and diet), no overlap was detected between their bacterial communities.Overall this thesis contributes to broadening our knowledge on the composition and structure of the gut bacterial communities in fish species, their possible biological roles and also in understanding the factors that influence interactions between hosts and gut microbiota.

Η παρούσα Διδακτορική διατριβή, επικεντρώθηκε στη μελέτη των αυτόχθονων βακτηριακών κοινοτήτων του γαστρεντερικού συστήματος έξι (6) ειδών εκτρεφόμενων ιχθύων (Sparus aurata, Dicentrarchus labrax, Diplodus puntazzo, Pagrus pagrus, Argyrosomous regius και Salmo salar). Σκοπός αποτέλεσε η ανίχνευση παραγόντων που συνθέτουν τις γαστρεντερικές βακτηριακές τους κοινότητες (γεωγραφική θέση – απόσταση, συνθήκες εκτροφής κλπ.), την εύρεση κοινών βακτηριακών ειδών σε αλλοπάτριους και συμπάτριους πληθυσμούς ιχθύων και ο προσδιορισμός του λειτουργικού τους ρόλου στο γαστρεντερικό τους σύστημα. Η βακτηριακή ανίχνευση στο DNA των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε με μεθόδους αλληλούχισης νέας γενιάς (Roche 454 FLX titanium και Illumina MiSeq 2x300), στοχεύοντας την περιοχή V3-V4 του γονιδίου 16S rRNA.Η μελέτη των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων σε εκτρεφόμενα άτομα (4-6) αλλοπάτριων πληθυσμών ιχθύων (S. aurata και D. labrax), από πέντε διαφορετικές και απομακρυσμένες μεταξύ τους μονάδες εκτροφής στην Ελλάδα (Ηγουμενίτσα, Αταλάντη, Γιάλτρα, Χίο, Χανιά), έδειξε ότι η γεωγραφική θέση – απόσταση, δεν επηρέασε σημαντικά τη δομή και σύνθεση των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων σε διαφορετικούς πληθυσμούς του ίδιου είδους, αλλά ούτε μεταξύ των διαφορετικών ειδών ιχθύων. Μάλιστα ανεξαρτήτου γεωγραφικής θέσης οι ιχθυοπληθυσμοί του κάθε είδους παρουσίασαν μια μικρή ομάδα κοινών OTUs (8 OTUs στο S. aurata και 10 στο D. labrax), ενώ 5 OTUs βρέθηκαν κοινά και στα δύο είδη, υποδεικνύοντας την παρουσία κοινών βακτηριακών εκπροσώπων ακόμα και μεταξύ διαφορετικών ειδών ιχθύων. Ο λόγος του μικρού αριθμού κοινών OTUs πιθανόν να οφείλεται στις ατομικές μεταβολές που παρατηρήθηκαν στις γαστρεντερικές βακτηριακές κοινότητες, ακόμα και σε άτομα μεταξύ των ίδιων πληθυσμών και πιθανόν να σχετίζονται με γενετικούς παράγοντες. Τα βακτηριακά είδη στο γαστρεντερικό σύστημα του κάθε είδους ιχθύος φαίνεται να παρουσιάζουν συνεργατικές αλληλεπιδράσεις και διαδραματίζουν διαφορετικούς βιολογικούς ρόλους στο κάθε είδος που μελετήθηκε (S. aurata και D. labrax).Για περαιτέρω μελέτη της επίδρασης της γεωγραφικής θέσης στην σύνθεση και δομή των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων των ιχθύων, μελετήθηκαν δείγματα μεσέντερου από άτομα (3-5) συμπάτριων εκτρεφόμενων πληθυσμών των ειδών ιχθύων D. puntazzo, P. pagrus, A. regius, S. aurata και D. labrax. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι παρόλο που οι γαστρεντερικές βακτηριακές τους κοινότητες δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές, μόνο ένα μικρό ποσοστό των OTUs (3,9%) βρέθηκε να είναι κοινό μεταξύ των προαναφερθέντων ειδών ιχθύων. Τα αποτελέσματα αυτά, υποδεικνύουν επιλεκτικές πιέσεις, ευνοώντας την εποίκιση και ανάπτυξη συγκεκριμένων βακτηριακών ειδών στο γαστρεντερικό σύστημα των πέντε ειδών ιχθύων.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη της επίδρασης των συνθηκών εκτροφής στην πρώτη αποίκιση και διαδοχή των βακτηριακών κοινοτήτων σε ιχθύδια των ειδών S. aurata και S. salar, υπέδειξαν ομοιότητες μεταξύ των εκτρεφόμενων ειδών και των βακτηριακών κοινοτήτων του νερού εκτροφής και των παρεχόμενων τροφών. Ωστόσο πλήρη επικάλυψη μεταξύ αυτών δεν παρατηρήθηκε. Και στις δύο περιπτώσεις, σημαντική παρατήρηση αποτέλεσε η ανίχνευση OTUs στα γονιμοποιημένα αυγά των δύο εκτρεφόμενων ειδών, που δεν ανιχνεύθηκαν στο νερό εκτροφής, υποδεικνύοντας την πιθανή προέλευση τους από το μικροβίωμα των γεννητόρων. Γενικά η τροφή δεν επηρέασε σημαντικά την σύνθεση και δομή των βακτηριακών κοινοτήτων κατά τα χρονικά σημεία που μελετήθηκαν, ούτε στην περίπτωση της υποκατάστασης τουιχθυελαίου με έλαιο φυτικής προέλευσης, σε διατροφική μεταχείριση του είδους S. salar. Αντιθέτως, στο είδος αυτό ο παράγοντας της ηλικίας φάνηκε να επιδρά στη βακτηριακή ποικιλομορφία του γαστρεντερικού του συστήματος.Θα πρέπει να αναφερθεί ότι μέσα από τη φυλογενετική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στις βακτηριακές κοινότητες όλων των ειδών που μελετήθηκαν, καταγράφηκε επικράτηση των βακτηριακών φύλων Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria και Bacteroidetes. Τα OTUs που ανιχνεύθηκαν σχετίζονται με βακτηριακά είδη που απομονώθηκαν από παρόμοια περιβάλλοντα, ενώ μερικά από αυτά (Weissela cibaria, Pseudomonas veronii, Ruegeria mobile κλπ.), όπως έχει καταγραφεί μέσα από άλλες εργασίες, φαίνεται να παρέχουν προβιοτικές ιδιότητες στα είδη ιχθύων που μελετήθηκαν εδώ.Συνολικά η παρούσα Διδακτορική διατριβή, συμβάλει στην διεύρυνση των γνώσεων μας για την σύνθεση και δομή των γαστρεντερικών βακτηριακών κοινοτήτων των ιχθύων, στις πιθανές βιολογικές τους σχέσεις και προσδιόρισε τους παράγοντες που τη μεταβάλλουν.