Μοριακή, δομική και καταλυτική μελέτη καινοτόμων βιοκαταλυτών (ημικυτταρινάσες) που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας

Abstract

Plant biomass degradation by hemicellulases remains one of the prerequisites for the efficient production of the so-called second generation biofuels from fermentable sugars. Glucuronoyl Esterases, GEs, belong to a recently discovered family of Carbohydrate Esterases, CE-15, which have been attributed the prevalent role of hydrolyzing the ester bonds between lignin alcohols and the 4-O-methyl-D-glucuronic acid side chains of glucoronoxylan. This specific bond is considered to be one of the main bottlenecks that impair the complete dissociation of lignin from the hemicellulosic carbohydrates. The present thesis focuses on a glucuronoyl esterase and also its mutant from the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila (synonym Sporotrichum thermophile, StGE2 and S213A StGE2, respectively) and a glucuronoyl esterase from the mesophilic microorganism Podospora anserina (PaGE1). More specifically, the present work involved studies performed on the hydrolysis of a commercially available synthetic substrate by StGE2 and PaGE1. The three-level experimental procedure developed can give rise to the discovery of new GEs. Furthermore, the synthetic potential of StGE2 was investigated through esterification and transesterification reactions in non conventional systems which also involved enzyme immobilization. StGE2 exhibited indications of biocatalytic ability to synthesize glucuronides when free under the conditions used in the study. To further examine the physiological role of GEs, isolation of lignin-carbohydrate complexes, LCCs, followed. These hypothetically bulk compounds are suggested to constitute the “enriched in ester bonds-targets”, which are natural substrates of the enzyme. The catalytic activity of StGE2 and the hemicellulases studied, is a step towards the elucidation of the physiological function of GEs. Finally, X-ray protein crystallography studies were carred out using StGE2 and S213A StGE2 mutant which led to the 3D structure determination of StGE2 and S213A at high resolution, 1.55 Å and 1.9 Å, respectively, and the determination of the S213A mutant in complex with MeGlcA crystal structure at 2.35 Å resolution. These are the first crystal structures of a CE-15 family thermophilic GE and a catalytically inactive StGE2 mutant in complex with a substrate analogue.

Η αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη χρήση ημικυτταρινασών παραμένει ένα από τα προαπαιτούμενα για την αποδοτική παραγωγή βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς από ζυμώσιμα σάκχαρα. Οι γλυκουρονικές εστεράσες (Glucuronoyl Esterases, GEs), ανήκουν σε μια πρόσφατα ανακαλυφθείσα οικογένεια υδατανθρακικών εστερασών (Carbohydrate Esterases, CEs), CE-15, που φέρονται να υδρολύουν τον εστερικό δεσμό μεταξύ των πλευρικών ομάδων του 4-O-μεθυλο-D-γλυκουρονικού οξέος της γλυκουρονοξυλάνης και αρωματικών αλκοολών της λιγνίνης. Ο συγκεκριμένος δεσμός θεωρείται ότι εκπροσωπεί ένα από τα δυσκολότερα στάδια που απαντώνται κατά την πλήρη αποδέσμευση της λιγνίνης από τους υδατάνθρακες που συνθέτουν την ημικυτταρίνη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δόθηκε έμφαση στην εστεράση του γλυκουρονικού Η αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη χρήση ημικυτταρινασών παραμένει ένα από τα προαπαιτούμενα για την αποδοτική παραγωγή βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς από ζυμώσιμα σάκχαρα. Οι γλυκουρονικές εστεράσες (Glucuronoyl Esterases, GEs), ανήκουν σε μια πρόσφατα ανακαλυφθείσα οικογένεια υδατανθρακικών εστερασών (Carbohydrate Esterases, CEs), CE-15, που φέρονται να υδρολύουν τον εστερικό δεσμό μεταξύ των πλευρικών ομάδων του 4-O-μεθυλο-D-γλυκουρονικού οξέος της γλυκουρονοξυλάνης και αρωματικών αλκοολών της λιγνίνης. Ο συγκεκριμένος δεσμός θεωρείται ότι εκπροσωπεί ένα από τα δυσκολότερα στάδια που απαντώνται κατά την πλήρη αποδέσμευση της λιγνίνης από τους υδατάνθρακες που συνθέτουν την ημικυτταρίνη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δόθηκε έμφαση στην εστεράση του γλυκουρονικού οξέος αλλά και μεταλλάγματός της από το θερμόφιλο μύκητα Myceliophthora thermophila (συνώνυμο Sporotrichum thermophile, StGE2 και S213A StGE2, αντίστοιχα), και στην εστεράση του γλυκουρονικού οξέος από το μεσόφιλο μικροοργανισμό Podospora anserina (PaGE1). Ειδικότερα, πραγματοποιήθηκαν μελέτες τόσο της StGE2 όσο και της PaGE1 ως προς την υδρόλυση εμπορικά διαθέσιμου συνθετικού υποστρώματος. Η πειραματική μεθοδολογία τριών σταδίων που αναπτύχθηκε αποτελεί έναυσμα για την ανακάλυψη και μελέτη νέων GEs. Παράλληλα, εξετάστηκε η StGE2 ως προς το συνθετικό δυναμικό μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης και μετεστεροποίησης σε μη συμβατικά συστήματα που περιελάμβανε επίσης την ακινητοποίησή της. Στην ελεύθερη μορφή του το ένζυμο εμφάνισε ενδείξεις σύνθεσης γλυκουρονιδίων. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η φυσιολογική δράση του ενζύμου μέσω απομόνωσης λιγνινο-υδατανθρακικών συμπλόκων (Lignin-Carbohydrate Complexes, LCCs) ως φυσικών υποστρωμάτων εμπλουτισμένα σε εστερικούς δεσμούς-στόχο για τις GEs. Η καταλυτική ενεργότητα της StGE2 αλλά και των ημικυτταρινασών που εξετάστηκαν, αποτελεί ένα βήμα προς τη διαλεύκανση του φυσικού ρόλου των GEs. Τέλος, έλαβαν χώρα κρυσταλλογραφικές μελέτες ακτίνων Χ με πρωτεϊνικούς στόχους την StGE2 και την S213A StGE2 που οδήγησαν στον προσδιορισμό των τρισδιάστατων δομών τους σε υψηλή ευκρίνεια 1.55 Å και 1.9 Å, αντίστοιχα, ενώ κατέστη επιτυχής ο προσδιορισμός της τρισδιάστατης κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου S213A – MeGlcA σε ευκρίνεια 2.35 Å. Οι συγκεκριμένες δομές αποτελούν τις πρώτες δομές θερμοάντοχης GE, GE που φέρει σημειακή μετάλλαξη σε καταλυτικό αμινοξύ ενώ αυτή του συμπλόκου αποτέλεσε την πρώτη δομή GE με ανάλογο υποστρώματος.