Μελέτη των γονιδίων του καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών BRCA1 και BRCA2 σε παιδιά με νεοπλασματικές παθήσεις και στις μητέρες τους

Abstract

Introduction: Breast and ovarian cancers are the most prevalent amongst women.The BRCA genes have found about 20 years ago and since great progress hasbeen achieved with respect to disease prognosis, diagnosis and treatment of breastand ovarian cancer. Yet, it is interesting, and troubling at the same time, that theincidence of breast and ovarian cancer increases with time something that couldattribute to the increase of life expectancy, environmental factors as well as hereditaryfactors. Similar incidence results appear in childhood malignancies, wherethe basic ontogenetic mechanisms still remain to be elucidated. Such approaches,of relating mothers’ mutations with the prevalence of childhood cancer in their offspringcould prove useful in the prognosis, early detection and therapy of childhoodmalignancies.Aim & Objectives: The aim of the present study was to investigate the incidenceof mutations in mothers with children suffering from neoplasms, whereas some ofthem have been patients for neoplasms themselves. For that purpose we havestudied mutations in known genes, already known for their role in carcinogenesis,such as BRCA, some of the RAS family genes, TP53 and FLT3, which is known forhis role in childhood acute leukemia. Further on, the present study aimed at theinvestigation of a probable hereditary mechanism of oncogenesis, which couldprobably predict the risk for neoplasm disease in children based on the mother’sgenetic profile. Such tools could prove very useful in the therapy of childhood malignanciesa potential links between mothers’ mutations and children could help todisease prognosis at the very early stages of the disease. The present study had apreliminary character, in such a way that aimed in giving the first correlation betweencancers in mothers to cancer in their children.Materials and Methods: The target group consisted of mothers whose childrenhad been hospitalized due to the incidence of cancer. At the same time some of themothers had been patients themselves for breast cancer and/or there was a familyhistory of cancer in the family. Genes were examined for mutations and in particular,those were BRCA1, RAS family genes, TP53 and FLT3. Mutations were initiallydetected using PCR and multiplex PCR methodologies. Gene expression wasdetected using qRT-PCR methodologies and results have been confirmed with thesequencing method. Following experimental analysis, bioinformatics analyses hasbeen performed. In the case of positive identification of mutations, molecular modellingwas used in order to study the effects of the mutations on the BRCA proteinand subsequent effects on binding to BARD1, a signaling molecule down-stream ofBRCA1, which participates in DNA repair pathways.Results: PCR methods detected a prevalence of BRCA1 up to 17% and 11% for exons2 and 20 respectively. KRAS mutations were up to 8% and 10% for exons 1 and2 respectively. TP53 mutations reached a 10% level. These findings were revealedusing PCR methodologies. Confirming those results with sequencing methods revealedthat some of the results were false positives, whereas almost half of the positivesamples did had a BRCA1 mutation. No mutations were found for BRCA2.Those results are in agreement with other studies both in the Greek population aswell as other ethnicities. It appeared that there was no positive correlation betweenmothers’ incidence of mutations with those of the children’s’. On the contrarythere was a negative correlation between those two factors indicating thatmothers’ mutation does necessarily affect the child’s neoplasmatic phenotype.Gene expression showed that BRCA1 and KRAS were in most cases down regulated,in agreement with other studies confirming the role of BRCA1 as a tumor suppressorgene. Finally, it appeared that BRCA1 mutations do affect the binding ofthe protein to BARD1, which consequently affects the function of the DNA repairpathway.Conclusions: Concluding, it appeared that the presence of a mutation in theaforementioned genes is not adequate for the disease to progress, yet it can beconsidered as a serious factor for disease progression. Further on, it appears thatthe negative correlation between mothers’ incidence of mutations and that of thechildren’s is specific only for obstetrical neoplasms and not for childhood neoplasms.Overall the final mother population was small due to the fact that breastand ovarian cancer present a peak around the age of 60, where children havereached adulthood. Thus, mothers that had young children hospitalized for cancerwere young and therefore the incidence of neoplasm within the mother populationwas small. Yet, it appears that this phenomenon is of extreme interest and it should be further investigated in a larger patient cohort.

Εισαγωγή: Οι νεοπλασίες γυναικολογικού τύπου, τόσο του μαστού όσο και των ωοθηκών αποτελούν τις συχνότερες νεοπλασματικές παθήσεις στις γυναίκες. Τα γονίδιαBRCA1 και BRCA2 ανακαλύφθηκαν περίπου πριν 20 χρόνια και από τότε έχει επιτελεσθεί μεγάλη πρόοδος στην πρόγνωση, διάγνωση αλλά και θεραπεία των γυναικολογικών νεοπλασιών. Το ενδιαφέρον, αλλά και ανησυχητικό, είναι ότι η επίπτωση των νεοπλασιών αυτών αυξάνει κάτι το οποίο μπορεί να αποδοθεί στην αύξηση του προσδόκιμου ζωής, σε περιβαλλοντικούς παράγοντες αλλά και στην κληρονομικότητα. ταυτοχρόνως, παρόμοια εικόνα φαίνεται να υπάρχει και στα παιδιατρικά νεοπλάσματα, ό-που η βασικές αιτίες της παθογένεσης είναι άγνωστες. Μια συσχέτιση των μεταλλάξεων των μητέρων, που έχουν νοσήσει από γυναικολογικό νεόπλασμα με την εμφάνιση νεοπλάσματος στα παιδιά τους θα μπορούσε να βοηθήσει στην πρόγνωση των παιδιατρικών νεοπλασιών αλλά και στην πρόληψη και θεραπεία.Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η επίπτωση των μεταλλάξεων στις μητέρες με παιδιά πάσχοντα από κάποια νεοπλασία καθώς και στα ίδια τα παιδιά. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκαν οι μεταλλάξεις σε γνωστά γονίδια, που έχουν ήδη ενοχοποιηθεί για το ρόλο τους στην καρκινογένεση, όπως είναι το γονίδιο BRCA,τα γονίδια της οικογένειας RAS, το TP53 αλλά και το γονίδιο FLT3, που είναι γνωστό για το ρόλο του στην παιδική λευχαιμία. Επίσης, η μελέτη αυτή αποσκοπούσε στην πιθανή ή μη, ταυτοποίηση ενός κληρονομικού επιβαρυντικού μηχανισμού, ενός μηχανισμού δηλαδή, ο οποίος θα μπορούσε να προβλέψει τον κίνδυνο εμφάνισης νεοπλασίας σε ένα παιδί με βάση το γονιδιακό προφίλ της μητέρας του. Τέτοια εργαλεία μπορούν να αποβούν πολύ χρήσιμα στην πρόγνωση αλλά και θεραπεία των παιδικών νεοπλασιών μιας και η πιθανή ύπαρξή τους θα μπορούσε να βοηθήσει στη διάγνωση και αντιμετώπιση σε πρώιμα στάδια, πριν την κλινική παρουσίαση στους παιδιατρικούς ασθενείς. Η παρούσα μελέτη είχε προκαταρκτικό χαρακτήρα και είχε ως στόχο να δώσει περισσότερα στοιχεία στη συσχέτιση μεταξύ των γυναικολογικών νεοπλασιών στις μητέρες και των νεοπλασιών στα παιδιά.Υλικό και μέθοδοι: Μητέρες των οποίων τα παιδιά είχαν νοσήσει από νεοπλασία αλλά καθώς και μέρος αυτών είχε επίσης νοσήσει από κάποια νεοπλασία ή υπήρχε ιστορικό νεοπλασίας στο οικογενειακό δέντρο εξετάστηκαν για μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA,τα γονίδια της οικογένειας RAS, το TP53 αλλά και το γονίδιο FLT3 (μόνο για τους παιδιατρικούς ασθενείς), που είναι γνωστό για το ρόλο του στην παιδική λευχαιμία. Χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, πολύ-παραμετρικής αντίδρασης πολυμεράσης, αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου και αλληλουχοποίηση νουκλεοτιδίων. Ακολούθησε βιοπληροφορική ανάλυση των παραγόμενων αποτελεσμάτων καθώς και διερεύνηση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐ-νης BRCA1 και της επίδρασης των μεταλλάξεων σε αυτή αναφορικά με τη σύζευξή της με την πρωτεΐνη BARD1, που συμμετέχει στη σηματοδοτική οδό επιδιόρθωσης τουDNA.Αποτελέσματα: Οι μεταλλάξεις για το γονίδιο BRCA1 στις μητέρες, ανιχνευτήκαν σε ποσοστό 17% και 11% αντίστοιχα για τα εξόνια 2 και 20 με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Το γονίδιο KRAS παρουσίασε μεταλλάξεις 8% και 10% για τα εξόνια 1 και 2 αντιστοίχως με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Οι μεταλλάξεις του γονιδίου P53, είχαν επίπτωση 10% επίσης με την ίδια μέθοδο. Η επαλήθευση των μεταλλάξεων με αλληλουχοποίηση νουκλεοτιδίων έδειξε ποσοστά κατά το ήμισυ για τα γονίδια BRCA1 και KRAS ενώ δεν κατέστει δυνατό να ανευρεθούν μεταλλάξεις για το γονίδιο BRCA2. Τα ποσοστά αυτά βρίσκονται πλησίον των διεθνών αναφορών για τις υπό μελέτη μεταλλάξεις τόσο στον Ελληνικό πληθυσμό όσο και σε άλλες εθνικές ομάδες. Οι μεταλλάξεις των μητέρων σε σχέση με αυτές των παιδιών έ-δειξαν αρνητική συσχέτιση και φάνηκε ότι δεν υπάρχει θετική σχέση μεταξύ τους. Η έκφραση των γονιδίων BRCA1 και KRAS έδειξε ότι στις περισσότερες περιπτώσεις ήταν υποεκφραζόμενα σε συνάφεια με άλλες μελέτες για υποέκφραση των γονιδίων αυτών σε νεοπλασίες γυναικολογικού τύπου όσο και στις παιδιατρικές νεοπλασίες. Τέλος οι μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA1 επηρεάζουν τη δράση της πρωτεΐνης ως προς την πρόσδεσή της με την πρωτεΐνη BARD1, που είναι σημαντικό μόριο για την επιδιόρθωση του DNA. Συμπεράσματα: Εν γένει, η παρουσία μεταλλάξεων δεν μπορεί να θεωρηθεί ικανή και αναγκαία συνθήκη για την εμφάνιση γυναικολογικού νεοπλάσματος, αλλά πιθανότατα σοβαρός επιβαρυντικός παράγων. Η μη ύπαρξη συσχέτισης των μεταλλάξεων μεταξύ μητέρων και παιδιών δείχνει ότι ενδεχομένως να μην υπάρχει μηχανισμός κληρονομικότητας για την παιδιατρική νεοπλασία αλλά μόνο για τις νεοπλασίες γυναικολογικού τύπου, όπως έχει αναφερθεί σε πολλαπλές μελέτες. Το τελικό δείγμα μητέρων που είχαν νοσήσει και ταυτοχρόνως είχαν παιδιά με κάποιο άλλο νεόπλασμα ήταν μικρός. Ο λόγος ήταν ότι δεν είναι πολύ εύκολο να ανευρεθεί μεγάλη ομάδα-στόχος μιας και ο επιπολασμός των γυναικολογικών νεοπλασιών φθάνει στο μέγιστό του μετά την ηλικία των 60, όπου τα παιδιά έχουν περάσει στην ενηλικίωση. Ως εκ τούτου, οι μητέρες που προσέρχονταν λόγω νεοπλασίας του παιδιού τους ήταν λίγες. Επειδή έχει εξαιρετικό ενδιαφέρον, τόσο από κλινικής άποψης όσο και βιολογικής, μελλοντικές μελέτες θα μπορούσαν να αυξήσουν το δείγμα και να γίνει μια κεντρική μελέτη για το φαινόμενο αυτό.