Παραγωγή stress - πρωτεϊνών (hsp70) στα φαγοκύτταρα του νεογνού

Abstract

Ιt is now well established that, when cells of different organisms are exposed to a variety of environmental stresses, including high temperature, anoxia, trauma, inflammation etc. induce the expression of a group of highly conserved proteins, known as heat shock proteins (hsp).The hsp play a vital role in the survival of cells exposed to stress. Particularity, they help cells pre-exposed to a non lethal stress to survive from subsequent exposure to lethal stress (thermotolerance). The most prominent and profoundly investigated member of this protein group is hsp of a molecular weight of about 70kDa (hsp70). The hsp70 provide protection not only against heat shock, but also against a wide range of other stresses. Invading pathogens represent a common and potentially fatal stress for the organism. Recent reports have shown that the induction of hsp70 reduces the mortality rates from sepsis in several animal models. Only a few studies have referred to human cells and particularly to the in vivo expression of hsp70 by peripheral blood cells. None study had been referred to production of hsp70 by neonatal cells. It is known that neonates have increased susceptibility to different stress-conditions (such as sepsis, anoxia etc). The present study was designed to investigate a) whether the neonatal polymorphonuclear (PMNs) have the ability to synthesize hsp70 and b) if this synthesis could protect the neonatal PMNs from stress-conditions like sepsis and anoxia.In the first part of this research we have studied venous blood PMNs derived from healthy fullterm and from neonates exposed to stress (sepsis, anoxia). PMNs from healthy adults served as controls. Using the method of Western-blotting we have found the following; 1. PMNs of healthy newborns have the ability to synthesize hsp70 and this synthesis is enhanced when PMNs are exposed to an in vitro stress (exposure of PMNs at a temperature of 42°C). Similar results have been obtained from PMNs of adults exposed to the same conditions. 2. PMNs from neonates with sepsis or hypoxia (that are from neonates exposed to an in vivo stress) had spontaneously overexpressed hsp70 and this expression was much higher than that observed from normal neonatal PMNs that have been exposed to an in vitro stress (temperature of 42°C) 3. PMNs of stressed neonates when exposed to an in vitro heat stress (42°C) continue to synthesize high amounts of hsp70, that were higher than the amount of hsp70 produced by PMNs of normal neonates exposed to similar heat stress.In the second part of this study we have investigated the role of hsp70 on the superoxide (0-2 ) generation from PMNs derived from normal and stressed neonates. It is known that 0-2 is the precursor substance of the bactericidal free radicals. The generation 0-2 was measured by the superoxide dismutase - inhibitable reduction of ferricytochrome C. We have found the following: 1. When PMNs of healthy newborns had been exposed to a heat shock (42°C) the generation of 0-2 was temporarily inhibited. This is in aggreement with the notion that cells under stress exhibit a repression of their function. However, the preexposure of these neonatal PMNs to a heat shock prevented the inhibition of O- 2 generation during a challenge of a second heat shock. This finding suggests that the neonatal PMNs acquired thermotolerance, as do the PMNs from adults. 2. The 0-2 generation from PMNs of stressed neonates is inhibited and the amount of 0-2 generated is significantly lower than that generated by healthy neonatal PMNs exposed to a heat shock. The 0-2 genaration from the PMNs of stressed neonates was not reestablished after a high temperature exposure in spite of the high production of hsp70 by these cells.Our results suggest that neonatal PMNs have the ability to synthesize hsp70. However, the hsp70 synthesis cannot protect the normal bactericidal function of the PMNs of stressed neonates and consequently their ability to fight against infections. This may be one of the mechanisms that can explain the high susceptibility of newborns to infection and the increased mortality of neonatal infections. Further investigations on the complex neonatal immunological mechanisms and on the complicated PMNs functions are mandatory if we want to confront neonatal infections that represent a potential danger for neonates.

Τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει δοθεί στη σύνθεση ειδικής ομάδας πρωτεϊνών, των πρωτεϊνών θερμικού stress ή heat shock proteins (hsp) που παράγονται ως απάντηση του κυττάρου σε διάφορα είδη stress, περιλαμβανομένης και της σήψης. Ρόλος των hsp είναι να διατηρούν σε συνθήκες stress τη σταθερότητα των πρωτεϊνών του κυττάρου αναστέλλοντας τη μετουσίωση και συσσώρευση αυτών, που θα έβλαπταν την κυτταρική λειτουργία.Έχει αποδειχθεί ότι οι hsp που παράγονται από την επίδραση ηπίων μορφών stress προστατεύουν το κύτταρο από επόμενα stress ισχυρότερα και δυνητικά θανατηφόρα. Το φαινόμενο αυτό της «αντοχής» του κυττάρου στα επόμενα stress, επειδή μελετήθηκε για πρώτη φορά σε πειράματα μετά από θερμικό stress, ονομάζεται θερμοαντοχή. Οι hsp70, οι οποίες αποτελούν τη σπουδαιότερη και πιο καλά μελετημένη ομάδα των hsp στα θηλαστικά και τον άνθρωπο, παίζουν «πρωταγωνιστικό» ρόλο στην απόκτηση θερμοαντοχής του κυττάρου. Πρόσφατες μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει ότι η επαγωγή της σύνθεσης hsp70 σε κύτταρα διαφόρων οργάνων (πνεύμονες, ήπαρ, έντερο κ.λπ.), η οποία προκλήθηκε μετά την έκθεση των πειραματόζωων σε αυξημένη θερμοκρασία καθιστά τα πειραματόζωα αυτά πιο ανθεκτικά στη χορήγηση ενδοτοξίνης ή σε διάφορους άλλους βλαπτικούς παράγοντες της σήψης, με αποτέλεσμα να μειώνονται οι επιπλοκές και η θνητότητα της νόσου. Με άλλα λόγια η σύνθεση των hsp70 δρα προστατεύοντας τα πειραματόζωα σε περίπτωση βαριάς λοίμωξης.Η σημασία των hsp στον ανθρώπινο οργανισμό πολύ λίγο έχει μελετηθεί. Υπάρχουν ελάχιστες μελέτες που αναφέρονται στην in vivo αυτόματη έκφραση των hsp σε ενήλικες και αυτές αφορούν στα φαγοκύτταρα του περιφερικού αίματος. Πρόσφατα έχει περιγραφεί αυξημένη αυτόματη σύνθεση hsp70 σε ΠΜΠ βαρέως πασχόντων πολυτραυματιών και χειρουργημένων, ως και σε μονοκύτταρα σηπτικών αρρώστων. Εν τούτοις δεν υπάρχουν μελέτες στον ανθρώπινο οργανισμό που να πιστοποιούν τον προστατευτικό ρόλο των hsp στην επιβίωσή του κατά τη σήψη ή άλλες δυνητικά θανατηφόρες καταστάσεις. Απ’ ότι γνωρίζουμε ουδεμία μελέτη υπάρχει που να αφορά τη σύνθεση hsp70 στα νεογνά. Είναι γνωστό ότι τα νεογνά συχνά βρίσκονται κάτω από συνθήκες έντονου stress όπως π.χ. σε καταστάσεις περιγεννητικής ασφυξίας και σήψης, οι οποίες είναι νόσοι με υψηλή θνητότητα στη νεογνική ηλικία. Πρέπει να τονιστεί ότι όσον αφορά στις λοιμώξεις ο ρόλος των πολυμορφοπυρήνων (ΠΜΠ) είναι σημαντικός για την εξουδετέρωση του παθογόνου αιτίου και ως εκ τούτου η διατήρηση ακέραιης της λειτουργικότητάς τους σε συνθήκες σήψης είναι σημαντική για την επιβίωση των νεογνών.Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν διπλός:α) να ελέγξουμε εάν τα ΠΜΠ των νεογνών έχουν τη δυνατότητα να συνθέσουν hsp70 και β) να διαπιστώσουμε αν οι πρωτεΐνες αυτές μπορούν να προστατεύσουν τα νεογνικά ΠΜΠ από την επίδραση διαφόρων ειδών stress (σηπτικό, ανοξαιμικό κ.λπ.) Για το σκοπό αυτό α) μελετήσαμε τη σύνθεση hsp70 από τα ΠΜΠ υγιών νεογνών και νεογνών που βρίσκονταν υπό την επίδραση έντονου in vivo stress (σήψη, περιγεννητική ασφυξία) και β) διερευνήσαμε το ρόλο των hsp70 στη λειτουργία των νεογνικών ΠΜΠ και συγκεκριμένα στην ικανότητα των ΠΜΠ να συνθέτουν υπεροξείδιο (0-2). Τούτο ως γνωστόν αποτελεί μητρική ουσία των μικροβιοκτόνων ελευθέρων ριζών. Με άλλα λόγια διερευνήσαμε έμμεσα τη μικροβιοκτόνο δράση των ΠΜΠ.Η σύνθεση hsp70 ελέγχθηκε με τη μέθοδο Western-blotting, η δε παραγωγή του 0-2 εκτιμήθηκε έμμεσα με τη μέθοδο της αναγωγής του κυτοχρώματος C.Πιο συγκεκριμένα στη διατριβή αυτή:1.Μελετήθηκε η σύνθεση των hsp70:1.1.σε δείγματα ΠΜΠ υγιών νεογνών και ενηλίκων, που είχαν εκτεθεί σε φυσιολογική θερμοκρασία (37 °C) και σε ένα in vitro θερμικό stress (42° C για 30 λεπτά).Βρέθηκε ότι τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών σε φυσιολογικές συνθήκες θερμοκρασίας συνθέτουν hsp70 σε ποσά ανάλογα αυτών που συνθέτουν τα ΠΜΠ των ενηλίκων στις ίδιες συνθήκες. Ενδιαφέρον είναι ότι σε συνθήκες θερμικού stress η σύνθεση των hsp70 από τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών είναι αυξημένη και δεν διαφέρει ουσιαστικά από την ανάλογη παραγωγή των ΠΜΠ των ενηλίκων στις ίδιες συνθήκες stress. Με άλλα λόγια, τα ΠΜΠ των νεογνών έχουν τη δυνατότητα να συνθέτουν hsp70, τα κύτταρά τους δηλ. διαθέτουν αυτόν τον δυνητικά προστατευτικό μηχανισμό.1.2.σε δείγματα ΠΜΠ σηπτικών και ανοξαιμικών νεογνών. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η σύνθεση hsp70 στα νεογνικά αυτά κύτταρα που βρίσκονταν ήδη σε συνθήκες in vivo stress, καθώς επίσης και μετά την έκθεση των κυττά- ρων αυτών σε in vitro θερμικό stress (στους 42°C για 30 λεπτά). Διαπιστώθηκε ότι τα ΠΜΠ των νεογνών που βρίσκονται σε in vivo stress συνθέτουν μεγαλύτερη ποσότητα hsp70 από τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών σε φυσιολογική θερμοκρασία (37°C). Σημαντικό εν τούτοις εύρημα είναι ότι η σύνθεση των hsp από τα ΠΜΠ των νεογνών σε stress είναι μεγαλύτερη ακόμα και από αυτήν που παρατηρήθηκε στα ΠΜΠ υγιών νεογνών που είχαν εκτεθεί σε ένα έντονο in vitro θερμικό stress. Επίσης διαπιστώθηκε ότι τα ΠΜΠ των νεογνών υπό stress μετά την επίδραση σ’ αυτά ενός in vitro θερμικού stress διατηρούν υψηλά τα επίπεδα των hsp70 που παράγουν, ανάλογα αυτών που παράγονται κατά το in vivo stress.2.Ελέγχθηκε η παραγωγή Ο-2:2.1 από τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών και ενηλίκων που είχαν εκτεθεί σε φυσιολογική θερμοκρασία (37° C) και όταν υπέστησαν την επίδραση δύο διαδοχικών θερμικών stress (έκθεση δύο φορές στους 42° C για 30 λεπτά με μεσοδιάστημα ηρεμίας 3 ωρών).Βρέθηκε ότι μετά την επίδραση του πρώτου θερμικού stress (πρώτη έκθεση στους 42° C) η παραγωγή Ο-2 από τα ΠΜΠ τόσο των νεογνών όσο και των ενηλίκων καταστέλλεται σημαντικά (ρ<0,001) συγκριτικά με εκείνη που παρατηρείται σε φυσιολογικές συνθήκες θερμοκρασίας. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με την καταστολή της κυτταρικής λειτουργίας από την επίδραση του έντονου θερμικού stress. Εν τούτοις, μετά την έκθεση στο δεύτερο θερμικό stress δεν παρατηρήθηκε καταστολή της παραγωγής του Ο-2, όπως είχε συμβεί μετά το πρώτο θερμικό stress. Η παραγωγή του Ο-2 μετά το δεύτερο θερμικό stress ήταν ανάλογη με εκείνη που παρατηρείται σε φυσιολογική θερμοκρασία (37° C).2.2 απότα ΠΜΠ των νεογνών που βρίσκονταν σε stress υπό τις παρακάτω συν-θήκες: Χρησιμοποιήθηκαν τρία δείγματα ΠΜΠ (με ίσον αριθμό κυττάρων το καθένα) από κάθε νεογνό με stress. Στο πρώτο δείγμα μετρήθηκε το Ο-2 αμέσως μετά την απομόνωση των ΠΜΠ. Το δεύτερο δείγμα επωάστηκε στους 42 °C για 30 λεπτά και το τρίτο δείγμα επωάστηκε δύο φορές στους 42° C για 30 λεπτά με μεσοδιάστημα ηρεμίας 3 ωρών. Μετά την επώαση κάθε δείγματος ακολούθησε η μέτρηση του παραγόμενου 0~2. Η διαδικασία αυτή θεωρήθηκε σκόπιμη για να διαπιστωθεί εάν τα ΠΜΠ των νεογνών υπό stress, τα οποία όπως αποδείχθηκε (βλ. παραπάνω 1.2) έχουν υψηλά επίπεδα hsp70, έχουν και τη δυνατότητα να παράγουν υψηλά επίπεδα 0~2, να διατηρούν δηλ. τη λειτουργικότητά τους.Βρέθηκε ότι τα ΠΜΠ των νεογνών υπό stress παράγουν 0~2 σε χαμηλά επίπεδα συγκριτικά με των ΠΜΠ των υγιών νεογνών υπό φυσιολογική θερμοκρασία (ρ<0,001). Επίσης βρέθηκε ότι τα επίπεδα του 0~2 στα νεογνά υπό stress παρέμειναν χαμηλά τόσο μετά την επίδραση ενός ή και δύο διαδοχικών θερμικών stress και δεν αποκαταστάθηκαν στα φυσιολογικά επίπεδα. Διαπιστώθηκε δηλ. ότι τα νεογνά που βρίσκονταν σε συνθήκες stress παρουσιάζουν σημαντική καταστολή της παραγωγής του 0~2 παρά τα υψηλά επίπεδα των hsp70 που διαθέτουν. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι, μετά την επίδραση διαδοχικών in vitro θερμικών stress, η παραγωγή του 0~2 παραμένει χαμηλή και δεν αποκαθίσταται σε φυσιολογικά επίπεδα, παρά το ότι τα επίπεδα των hsp70 διατηρούνται υψηλά. Φαίνεται ότι στα νεογνά υπό stress τα υψηλά επίπεδα των hsp70 δεν καθιστούν τα ΠΜΠ αυτών ανθεκτικά στην επίδραση επόμενων stress, σε αντίθεση απ’ ότι συμβαίνει στα υγιή νεογνά όπου η έκθεση σε διαδοχικά stress διατηρεί τη λετουργικότητα των κυττάρων σε φυσιολογικά επίπεδα.Συμπερασματικά, από τη μελέτη μας φαίνεται ότι τα ΠΜΠ των νεογνών αν και έχουν την ικανότητα να συνθέτουν hsp70, (διαθέτουν δηλαδή αυτόν τον προστατευτικό μηχανισμό του κυττάρου), αδυνατούν σε συνθήκες συνεχούς stress (όπως σήψη, ανοξία κ.ά.) να διατηρήσουν τη φυσιολογική μικροβιοκτόνο τους δράση. Η αδυναμία αυτή προφανώς αποτελεί έναν από τους λόγους για τη βαρύτερη πρόγνωση της νεογνικής σηψαιμίας και υποδεικνύει την ανάγκη αναζήτησης νέων θεραπευτικών μεθόδων που να ευοδώνουν τη λειτουργικότητα των κυττάρων.