Μοριακή μελέτη των γονιδίων BRCA1 και BRCA2 σε Έλληνες ασθενείς με κληρονομούμενο καρκίνο μαστού και ωοθηκών

Abstract

85 Greek patients with hereditary breast and ovarian cancer were tested with the protein truncation test (PTT) for mutations in peripheral blood DNA in exon 11 of the BRCA1 gene and exons 10 and 11 of the BRCA2 gene (60% of the coding region of both genes). Totally eight deleterious mutations were detected and identified with automated DNA Sequencing: six in BRCA1 (3741insA, 1623del5, 3099delT, 3277insG, R1203X και 3896delT) and two in BRCA2 (2024del5 in exon 10 και 6631del5 in exon 11). Two of them are novel mutations reported for the first time in the literature (3099delT, 3277insG). Then, in tumor samples of 20 patients from the above group, prognostic factors of breast cancer were evaluated like ER, PgR, p53, Ki-67 and c-erbB-2 with immunohistochemistry and ploidy, DNA Index and proliferative phase with image cytometry. The tumors of five patients that tested positive for BRCA1 mutation (in peripheral blood) are negative for ER content and c-erbB-2 overexpression while in parallel they possessed intense proliferation (high Ki-67 and proliferative phase, giant cells in two). Two of the BRCA1 patients were recorded as medullary breast carcinomas in their histology report. The above reported phenotypic biological characteristics could assist in the detection of more genotypic changes in the highly penetrant BRCA1 gene. Therefore in a population-based study of patients fulfilling the aforementioned criteria, the recurrent 5382insC BRCA1 mutation was detected in one patient with PSM-PCR-RFLP methodology. Also, an immunohistochemical technique for the detection of BRCA1 protein was developed (MS110 mAb) and then applied: a) in a group of 30 sporadic breast cancer tumors where the range and intensity of positivity were recorded and b) in the 5 BRCA1 positive tumors (3 were assigned negative for BRCA1 protein). Finally, methods for the measurement of BRCA1 mRNA levels were developed: a) a semi quantitative hybridization method for PCR products and chemiluminescent detection in an ELISA microtiter plate and b) a sensitive quantitative method for BRCA1-mRNA with real time RT-PCR with the use of a Taqman DNA probe, conjugated with the fluorescent fluorescein dye and continuous monitoring in the Light Cycler instrument. This second method was applied: a) in peripheral blood samples of patients with breast cancer for the investigation of detection of circulating cancer cells where after checking healthy blood donors, positive BRCA1 signal was detected in 13/41 (32%) samples of metastatic breast cancer and b) in cultures of the MCF-7 breast cancer cell line after treatment with chemotherapeutic agents or radiation.

Σε 85 Έλληνες ασθενείς με κληρονομούμενο καρκίνο μαστού και ωοθηκών εφαρμόστηκε σε DNA περιφερικού αίματος, δοκιμασία πρόωρου τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης (PTT) στο εξόνιο 11 του γονιδίου BRCA1 και στα εξόνια 10 και 11 του γονιδίου BRCA2 (60% της κωδικοποιούσης περιοχής των δύο γονιδίων). Ανιχνεύθηκαν συνολικά οκτώ παθογνωμικές μεταλλάξεις και ταυτοποιήθηκαν με την αυτοματοποιημένη μέθοδο του προσδιορισμού της αλληλουχίας DNA: έξι στο BRCA1 (3741insA, 1623del5, 3099delT, 3277insG, R1203X και 3896delT) και δύο στο BRCA2 (2024del5 στο εξόνιο 10 και 6631del5 στο εξόνιο 11). Οι δύο από τις οκτώ αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία (3099delT, 3277insG). Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν σε δείγματα όγκου από 20 από τους παραπάνω ασθενείς, προγνωστικοί δείκτες καρκίνου μαστού όπως οι ER, PgR, p53, Ki-67 και c-erbB-2 με ανοσοϊστοχημική μέθοδο και πλοειδισμός, δείκτης DNA και αναπαραγωγική φάση με κυτταρομετρητή εικόνας. Οι όγκοι πέντε ασθενών θετικών για μετάλλαξη στο BRCA1 (στο περιφερικό αίμα), είναι αρνητικοί ως προς ER και υπερέκφραση c-erbB-2 ενώ παράλληλα διαθέτουν έντονο πολλαπλασιασμό (υψηλά Ki-67 και αναπαραγωγική φάση, γιγαντοκύτταρα σε δύο). Δύο από τους ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA1 διέθεταν τον ιστολογικό υπότυπο του μυελοειδούς καρκινώματος μαστού. Τα παραπάνω ευρεθέντα φαινοτυπικά βιολογικά χαρακτηριστικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανεύρεση περισσότερων γονοτυπικών αλλαγών στο υψηλής διεισδυτικότητας BRCA1 γονίδιο. Έτσι σε πληθυσμιακή μελέτη ασθενών που πληρούσαν τα ανωτέρω κριτήρια, ανιχνεύθηκε σε έναν ασθενή η συχνή μετάλλαξη 5382insC του BRCA1 με PSM-PCR-RFLP μεθοδολογία. Αναπτύχθηκε επίσης ανοσοϊστοχημική μέθοδος για την ανίχνευση της πρωτεΐνης BRCA1 (MS110 mAb) και στη συνέχεια εφαρμόστηκε: α) σε δείγμα 30 σποραδικών καρκίνων μαστού όπου και καταγράφηκε το εύρος και η ένταση της θετικότητας και β) στους 5 θετικούς για μετάλλαξη BRCA1 όγκους (οι 3 ευρέθησαν αρνητικοί ως προς την παρουσία πρωτεΐνης BRCA1). Τέλος, για την μέτρηση των επιπέδων του BRCA1 mRNA αναπτύχθηκαν: α) ημιποσοτική μέθοδος υβριδισμού προϊόντων PCR αντίδρασης και χημειοφωταυγούς ανίχνευσης σε μικροπλακίδιο τύπου ELISA και β) ευαίσθητη ποσοτική μέθοδος προσδιορισμού του BRCA1-mRNA με μεθοδολογία RT-PCR σε πραγματικό χρόνο (real time), με χρήση ειδικού DNA ανιχνευτή υβριδισμού τεχνολογίας Taqman, επισημασμένου με τη φθορίζουσα χρωστική φλουορεσκεΐνη και παρακολούθηση της αντίδρασης στο όργανο Light Cycler. Η δεύτερη μέθοδος εφαρμόστηκε: α) σε δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών με καρκίνο μαστού για την διερεύνηση της ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων όπου αφού ελέγχθηκαν εθελοντές υγιείς αιμοδότες, θετικό BRCA1 σήμα ελήφθη σε 13/41 (32%) δείγματα με μεταστατικό καρκίνο μαστού και β) σε καλλιέργειες της καρκινικής σειράς MCF-7 έπειτα από επίδραση χημειοθεραπευτικών ουσιών ή ακτινοβολιών.