Περίληψη
Στον ανθρώπινο οργανισμό, η κυτταρική απόκριση σε περίπτωση βλάβης στο DNA, συνίσταται σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου στα σημεία ελέγχου του και ενεργοποίηση των επιδιορθωτικών μηχανισμών του κυττάρου. Ενδεχόμενη αδυναμία επιδιόρθωσης αυτής οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση ή καρκινογένεση.Η κυτταρική απόκριση ρυθμίζεται από ένα δίκτυο μονοπατιών σηματοδότησης, με τη συμμετοχή πλήθους μορίων, μεταξύ των οποίων κρίσιμο ρόλο έχουν τα μόρια CHK2, NEK1, BRCA1 και BRCA2, τα οποία μελετήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή.Η πρωτεΐνη CHK2 είναι μια φυλογενετικά συντηρημένη κινάση σερίνης-θρεονίνης, η οποία μέσω φωσφορυλίωσης ποικίλων υποστρωμάτων, συμβάλλει στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, στην ενεργοποίηση επιδιορθωτικών μηχανισμών και στην απόπτωση. Η πρωτεΐνη ΝΕΚ1 παρουσιάζει διπλή δράση κινάσης, σερίνης-θρεονίνης και τυροσίνης, και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση, συμβάλλοντας μεταξύ άλλων στην ενεργοποίηση των κινασών CHK1 και CHK2, στη σωστή λειτουργία του ...
Στον ανθρώπινο οργανισμό, η κυτταρική απόκριση σε περίπτωση βλάβης στο DNA, συνίσταται σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου στα σημεία ελέγχου του και ενεργοποίηση των επιδιορθωτικών μηχανισμών του κυττάρου. Ενδεχόμενη αδυναμία επιδιόρθωσης αυτής οδηγεί το κύτταρο σε απόπτωση ή καρκινογένεση.Η κυτταρική απόκριση ρυθμίζεται από ένα δίκτυο μονοπατιών σηματοδότησης, με τη συμμετοχή πλήθους μορίων, μεταξύ των οποίων κρίσιμο ρόλο έχουν τα μόρια CHK2, NEK1, BRCA1 και BRCA2, τα οποία μελετήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή.Η πρωτεΐνη CHK2 είναι μια φυλογενετικά συντηρημένη κινάση σερίνης-θρεονίνης, η οποία μέσω φωσφορυλίωσης ποικίλων υποστρωμάτων, συμβάλλει στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, στην ενεργοποίηση επιδιορθωτικών μηχανισμών και στην απόπτωση. Η πρωτεΐνη ΝΕΚ1 παρουσιάζει διπλή δράση κινάσης, σερίνης-θρεονίνης και τυροσίνης, και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση, συμβάλλοντας μεταξύ άλλων στην ενεργοποίηση των κινασών CHK1 και CHK2, στη σωστή λειτουργία του μονοπατιού της ATR, καθώς και στη διατήρηση της χρωμοσωμικής σταθερότητας. Από την άλλη, τα μόρια BRCA1 και BRCA2 συμμετέχουν στο μηχανισμό επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, o οποίος αποτελεί τον κυριότερο και πιο αλάθητο μηχανισμό επιδιόρθωσης των θραύσεων της διπλής έλικας του DNA, μετά τη φάση S. Το BRCA1 κατέχει εξέχοντα ρόλο στο μηχανισμό αυτό, αφού συμμετέχει στη δημιουργία τουλάχιστον τεσσάρων λειτουργικά διαφορετικών συμπλόκων. Παράλληλα, συμμετέχει και στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου, μέσω του μονοπατιού ATR-CHK1 και της αλληλεπίδρασης με τον μεταγραφικό παράγοντα p53, ενώ υπάρχουν ενδείξεις συμμετοχής του και σε άλλους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς.Η σπουδαιότητα των παραπάνω μορίων αναδεικνύεται με την επίδραση γενετικών αλλαγών στα γονίδια αυτών στο φαινότυπο των ατόμων που τις φέρουν.Μεταλλάξεις στο γονίδιο CHEK2 έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση κακοήθειας, κυρίως μαστού, αλλά και παχέος εντέρου, προστάτη, στομάχου και θυρεοειδούς. Η χρήση νέων μοριακών μεθόδων μαζικής παράλληλης αλληλούχησης στο γενετικό έλεγχο των ασθενών με καρκίνο, αποκάλυψε πληθώρα ευρημάτων στο γονίδιο αυτό, την πλειονότητα των οποίων συνιστούν παραλλαγές αγνώστου κλινικής σημασίας. Η ανάγκη κλινικής διαχείρισης των ασθενών που τις φέρουν, σε συνδυασμό με την απουσία τους από επιδημιολογικές μελέτες, ώθησε τη διατριβή αυτή στην ανάπτυξη μιας λειτουργικής δοκιμασίας για την αξιολόγησή τους, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο το σύστημα του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae.Με τη λειτουργική δοκιμασία αναλύθηκαν 122 παραλλαγές του γονιδίου CHEK2: 120 παρανοηματικές παραλλαγές και 2 μεγάλες γονιδιακές αναδιατάξεις που δεν τροποποιούν το πλαίσιο ανάγνωσης. Σύγκριση του ρυθμού ανάπτυξης των στελεχών που τις φέρουν με θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, έδειξε ότι 32 παρανοηματικές παραλλαγές και οι 2 γονιδιακές αναδιατάξεις συμπεριφέρθηκαν ως μη-λειτουργικές (παθογόνοι), 73 ως λειτουργικές (μη-επιβλαβείς) και 15 ως περιορισμένης λειτουργικότητας (ενδιάμεσης λειτουργικότητας). Η πλειονότητα των παθογόνων παραλλαγών εντοπίστηκε στην περιοχή κινάσης και στην περιοχή FHA της CHK2. Παράλληλα, ανάλυση με υπολογιστικά εργαλεία και σύγκριση των αποτελεσμάτων με εκείνα της λειτουργικής δοκιμασίας, αποκάλυψε συμφωνία για την πλειονότητα των παραλλαγών που συμπεριφέρθηκαν ως παθογόνοι. Επίσης, ο χαρακτηρισμός σχετίζεται με ισχυρό οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του μαστού, για τις παθογόνους παραλλαγές για τις οποίες υπήρχαν τα αντίστοιχα δεδομένα. Σύγκριση των αποτελεσμάτων της παρούσας μελέτης με δεδομένα άλλων λειτουργικών δοκιμασιών αποκάλυψε συμφωνία για 9 από 18 παραλλαγές που εξετάστηκαν, ενώ για ορισμένες παραλλαγές χρησιμοποιήθηκε και δομικό μοντέλο για την πρόβλεψη επίπτωσης στη δομή και λειτουργία της παραγόμενης πρωτεΐνης. Η μελέτη αυτή, η οποία αποτελεί παγκοσμίως τη μεγαλύτερη, μέχρι σήμερα, ανάλυση παραλλαγών του γονιδίου CHEK2, δύναται να συμβάλλει στην τελική κατηγοριοποίηση σπάνιων παραλλαγών του CHEK2 με ασαφή κλινική σημασία.Από την άλλη, μεταλλάξεις στο γονίδιο ΝΕΚ1 έχουν συσχετιστεί με την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση και το σύνδρομο βραχέας πλευράς-πολυδακτυλίας τύπου II. Η εύρεση δύο παραλλαγών στα εξόνια 20 και 26 του γονιδίου αυτού στο γενετικό υλικό ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος, που παρουσιάστηκε σε μια πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη, οδήγησε, στο πλαίσιο της διατριβής αυτής, σε ανάλυση 181 δειγμάτων DNA από περιφερικό αίμα ασθενών με αδενοκαρκίνωμα παγκρέατος για γαμετικές μεταλλάξεις στα εξόνια 20, 21, 22, 25 και 26 του γονιδίου ΝΕΚ1.Κατά την ανάλυση, εντοπίστηκαν τρεις παρανοηματικές παραλλαγές του γονιδίου, οι p.ΑΙa626Thr, p.Αsn745Lys και p.Glu752Gly, σε ποσοστά 11,6%, 1,1% και 19,9%, αντίστοιχα. Παρόλο που η πλειονότητα των in silico εργαλείων με τα οποία αυτές αναλύθηκαν προτείνει την παθογονικότητα των συγκεκριμένων παραλλαγών, στοιχεία που συλλέχθηκαν από διεθνείς βάσεις δεδομένων αντιβαίνουν σε αυτόν το χαρακτηρισμό. Επομένως, από την παρούσα μελέτη, δεν αποδείχθηκε συσχετισμός των παραλλαγών του γονιδίου NEK1 με την εμφάνιση καρκίνου του παγκρέατος.Όσον αφορά τα γονίδια BRCA1 και BRCA2, παθογόνοι παραλλαγές στη γαμετική σειρά στα γονίδια αυτά έχουν συσχετιστεί με την εμφάνιση καρκίνου μαστού και ωοθηκών, αλλά και παγκρέατος, προστάτη, στομάχου και παχέος εντέρου. Η συμμετοχή των μορίων αυτών στο μηχανισμό επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού, αποτέλεσε τη βάση για την ανάπτυξη μιας στοχευμένης θεραπείας που επιτελείται από τους αναστολείς της PARP, κατά την οποία η ανεπάρκεια των επιδιορθωτικών μηχανισμών μονής και διπλής αλύσου αποδεικνύεται καθοριστική, έχοντας ως συνέπεια τη «συνθετική θνησιμότητα» των καρκινικών κυττάρων.Λόγω της αναφερόμενης, στην πρόσφατη βιβλιογραφία, υψηλής συχνότητας εντοπισμού μεταλλάξεων στα γονίδια αυτά σε δείγματα ιστών από καρκινώματα ωοθηκών επιθηλιακού τύπου, και κυρίως σε ορώδη καρκινώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας, αναλύθηκαν 133 δείγματα ασθενών με καρκίνο ωοθηκών επιθηλιακού τύπου, για σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2, χρησιμοποιώντας DNA από ιστούς εγκλεισμένους σε παραφίνη. Από την ανάλυση προέκυψαν 15 δείγματα θετικά για παθογόνους παραλλαγές στο γονίδιο BRCA1 και 2 στο BRCA2 (συνολικά και για τα δύο γονίδια ποσοστό 12,8%), με πιο συχνή την παραλλαγή p.Val1833Met, η οποία ανιχνεύθηκε σε 5 δείγματα. Οι ασθενείς που φέρουν τις εν λόγω σωματικές μεταλλάξεις έχουν ήδη ενταχθεί σε θεραπευτικά πρωτόκολλα με αναστολείς της PARP.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
In the human body, cells respond to DNA damage by inducing cell-cycle arrest at its checkpoints, as well as by activating DNA repair mechanisms. Failure of these processes may lead to apoptosis or carcinogenesis.Cellular response is regulated by a network of signaling pathways with the participation of multiple molecules, among which CHK2, NEK1, BRCA1 and BRCA2, that were studied in the present thesis, play a crucial role.CHK2 protein is a phylogenetically conserved serine-threonine kinase, which participates in cell-cycle arrest, activation of DNA repair mechanisms and apoptosis, through phosphorylation of several substrates. NEK1 protein, which exhibits dual kinase activity, namely serine-threonine and tyrosine, plays an important role in cellular response, as it contributes to CHK1 and CHK2 activation, proper function of ATR pathway, as well as maintenance of chromosomal stability. On the other hand, BRCA1 and BRCA2 molecules participate in homologous recombination repair, which is ...
In the human body, cells respond to DNA damage by inducing cell-cycle arrest at its checkpoints, as well as by activating DNA repair mechanisms. Failure of these processes may lead to apoptosis or carcinogenesis.Cellular response is regulated by a network of signaling pathways with the participation of multiple molecules, among which CHK2, NEK1, BRCA1 and BRCA2, that were studied in the present thesis, play a crucial role.CHK2 protein is a phylogenetically conserved serine-threonine kinase, which participates in cell-cycle arrest, activation of DNA repair mechanisms and apoptosis, through phosphorylation of several substrates. NEK1 protein, which exhibits dual kinase activity, namely serine-threonine and tyrosine, plays an important role in cellular response, as it contributes to CHK1 and CHK2 activation, proper function of ATR pathway, as well as maintenance of chromosomal stability. On the other hand, BRCA1 and BRCA2 molecules participate in homologous recombination repair, which is the most important and error-free mechanism for repairing double-strand DNA breaks, after the S-phase. BRCA1 plays a key role in this mechanism, as it participates in the creation of at least four functionally-distinct complexes. In parallel, it participates in cell-cycle arrest, through the ATR-CHK1 pathway and by interacting with the p53 transcription factor. Finally, involvement of BRCA1 in other DNA repair mechanisms has also been suggested.The significance of the above molecules in cellular processes is proven by the impact of relative genetic variants on the carriers’ phenotypes.CHEK2 gene mutations have been associated with cancer predisposition, mainly of the breast, colon, prostate, gastric and thyroid. The use of new molecular methods of massive parallel sequencing in cancer patient genetic testing has revealed a plethora of findings in this gene, the majority of which are variants of unknown clinical significance. The need for clinical management of these patients and the rarity of CHEK2 variants in epidemiological studies, prompted us in developing a functional assay for variant evaluation in the context of this study, using Saccharomyces cerevisiae as a model system.With the use of this functional assay, 122 CHEK2 variants were analyzed, namely 120 missense variants and 2 large in-frame deletions. Comparison of the growth rate of these strains with both positive and negative controls, showed that 32 missense variants and the 2 in-frame deletions behaved as non-functional (pathogenic), 73 as functional (benign) and 15 as semi-functional (intermediate). The majority of pathogenic variants was located in the CHK2 kinase and FHA domains. Simultaneously, comparison of computational analysis results with those from the functional assay revealed agreement for the majority of variants that were characterized as pathogenic. In addition, the assay-obtained characterization was consistent with strong breast cancer family history, where data were available. Comparison of our present study results with data from other functional assays revealed agreement for 9 out of 18 variants that were alanyzed, whereas a structural model was used for some variants, in order to predict the relative effect on the structure and function of the produced protein. This study, which is the largest to-date analysis of CHEK2 variants globally, may contribute to the final classification of rare CHEK2 variants of uncertain clinical significance.On the other hand, NEK1 mutations have been previously associated with amyotrophic lateral sclerosis and short-rib polydactyly syndrome-type II. Identification of two NEK1 variants, in exons 20 and 26, in pancreatic cancer patients during genetic testing, in a recently published study, prompted us to analyze 181 DNA samples from peripheral blood of pancreatic adenocarcinoma patients for genetic mutations in exons 20, 21, 22, 25 and 26 of NEK1 gene.Analysis revealed three missense variants, namely p.ΑΙa626Thr, p.Αsn745Lys and p.Glu752Gly, in 11.6%, 0.01% and 19.9% of the samples, respectively. Although the majority of in silico tools used for analysis indicated pathogenicity of these variants, data collected from international databases were in disagreement with this characterization. Therefore, no correlation of NEK1 variants with pancreatic cancer occurrence was proven in the present study.Regarding BRCA1 and BRCA2, pathogenic genetic variants in these genes have been associated with breast and ovarian cancer, as well as with pancreatic, prostate, gastric and colon cancer. The involvement of these molecules in DNA repair mechanism through homologous recombination was the basis for the development of a targeted therapy using PARP inhibitors, which combines the simultaneous deficiency of single- and double-stand break repair mechanisms, resulting in “synthetic lethality” of cancer cells.Due to the high frequency of BRCA1/2 mutations in epithelial ovarian carcinoma tissue samples, mainly in high-grade serous carcinomas, as described in recently published studies, 133 formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples from epithelial ovarian cancer patients, were analyzed for somatic mutations in BRCA1 and BRCA2 genes. Pathogenic variants in BRCA1 and BRCA2 genes were identified in 15 and 2 samples (in total 12.8%), respectively, most common of which was the p.Val1833Met variant identified in 5 samples. As a result of the analysis, patients carrying these somatic mutations have already been included in therapeutic protocols with PARP inhibitors.
περισσότερα