Μελέτες επίδρασης επιλεγμένων φαρμάκων διαφορετικών συγκεντρώσεων σε φυσιολογικά κύτταρα, με βιοχημικές και βιοφυσικές μεθόδους

Abstract

Ultradilute, succussed solutions of pharmaceutically active chemical compounds have been used therapeutically on humans, animals and plants for the past two centuries. They present an exciting yet controversial area of research as regards both their composition and their effect on living organisms. In the present doctoral research, a variety of methods were utilised to assess the effect of low dilution and ultradilution of toxic compounds, on biological systems.In keeping with a systems approach, the experimental protocols chosen for this doctoral research focused on measuring the effect of ultradilution on systemic - as opposed to isolated - parameters. In electrophysiology, this entailed measuring local field potentials and compound action potentials resulting from the synchronous neural activity of animal brain slices and sciatic nerve fibres, respectively. For animal behavioural experiments, parameters were measured related to whole-animal motility, emotionality and analgesia. For cytotoxicity and genotoxicity experiments, the focus was on the survival of cell populations, as opposed to more specific molecular parameters. Spectroscopic studies were also performed on a number of ultradilute solutions, in order to verify previously reported findings but, more importantly, to test for the first time the spectroscopic performance of such solutions in the Terahertz region, as well as to test our hypothesis that “ammoniated electrons” possibly form as a result of the succussion process.The original contribution to Science made by this doctoral research is based on our results obtained with cytotoxicity and genotoxicity protocols. It amounts to a rethinking of the constraints and issues regarding a finding commonly mentioned in the scientific literature of ultradilute solutions, namely that ultadilute succussed solutions often effect biological actions in a way that resembles an “oscillatory” response of the parameter under study. Our most interesting, statistically significant findings were obtained by using dilutions of two widely used chemotherapeutic agents, cisplatin and oxaliplatin on healthy and malignant cell lines. The sulphorodamine B and 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (“MTT”) colorimetric cell viability assays, and the single-cell gel electrophoresis (“Comet”) genotoxicity assay were used to test cells maintained in culture, after administering various standard, low and ultra-low doses of cisplatin and oxaliplatin. In some cases this produced an unexpected, statistically significant "bimodal" response, with alternating peaks of cytoprotection and cytotoxicity compared to the control. This was observed when toxins were administered to the cells without prior sensitisation but also when they were administered after presensitising the cells with a different toxic concentration of the respective platinum compound. This observation agrees with various reports from the scientific literature stating that low and ultra-low dilutions of toxic compounds can reverse, or protect against, the effects of higher dilutions; occasionally, biphasic-type responses are seen, with alternating high and low peaks of the biological parameter under study. This has generally been attributed to a “harmonic resonance” effect with respect to the sensitivity of predisposed or presensitised biological systems against the concentration of certain toxic agents. In the discussion of our findings, we elaborate on issues related to this “oscillatory” response and pinpoint areas of focus for future research.

Υπεραραιά, δυναμοποιημένα διαλύματα φαρμακολογικά δραστικών χημικών ουσιών χορηγούνται με θεραπευτικό σκοπό σε ανθρώπους, ζώα και φυτά εδώ και δύο αιώνες. Τα διαλύματα αυτά αποτελούν ένα συναρπαστικό όσο και αμφιλεγόμενο πεδίο έρευνας, τόσο ως προς τη σύστασή τους όσο και ως προς τη δράση τους πάνω στους βιολογικούς οργανισμούς. Στην προκείμενη διδακτορική έρευνα, διαφορετικές μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για να μελετηθεί η επίδραση χαμηλών και υπεραραιών συγκεντρώσεων από τοξικούς παράγοντες, πάνω σε βιολογικά συστήματα. Σε συμφωνία με μια συστημική προσέγγιση, τα πειραματικά πρωτόκολλα που επιλέχθηκαν για την προκείμενη διδακτορική έρευνα εστίασαν στη διερεύνηση της επίδρασης της υπεραραίωσης σε συστημικές - παρά σε μεμονωμένες - παραμέτρους. Στις μελέτες ηλεκτροφυσιολογίας, αυτό μεταφράστηκε σε καταγραφή τοπικών δυναμικών πεδίου και σύνθετων δυναμικών ενεργείας από ζωικές εγκεφαλικές τομές και ισχιακά νεύρα, αντίστοιχα. Στις συμπεριφορικές μελέτες ζώων, οι παράμετροι που αξιολογήθηκαν αφορούσαν συνολικά την κινητικότητα, τη συναισθηματική κατάσταση και την αναλγησία του ζώου. Στις μελέτες κυτταρικής επιβίωσης, κυτταροτοξικότητας και επίδρασης στο γενετικό υλικό, η εστίαση ήταν στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυτταρικών πληθυσμών, παρά σε μεμονωμένες μοριακές παραμέτρους. Επίσης διενεργήθηκαν φασματοσκοπικές μελέτες ενός αριθμού υπεραραιών διαλυμάτων σε μεγάλη περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος με σκοπό, αφ’ενός, την επιβεβαίωση δημοσιευμένων αποτελεσμάτων, αφ’ετέρου, τη δοκιμασία για πρώτη φορά της φασματοσκοπικής συμπεριφοράς των υπεραραιών διαλυμάτων στην περιοχή της ακτινοβολίας Terahertz και, τέλος, τη διερεύνηση της υπόθεσής μας για ενδεχόμενο σχηματισμό “αμμωνιωμένων ηλεκτρονίων” κατά την κρούση των υπεραραιών διαλυμάτων.Η πρωτότυπη συνεισφορά της προκείμενης διδακτορικής έρευνας στην Επιστήμη αφορά κυρίως τα αποτελέσματά μας από τα πρωτόκολλα κυτταροτοξικότητας και επίδρασης στο γενετικό υλικό. Συνίσταται σε μια αναθεώρηση των περιορισμών και ζητημάτων που συχνά αναφέρονται στη βιβλιογραφία των υπεραραιών διαλυμάτων και αφορούν την παρατήρηση πως τα υπεραραιά διαλύματα τείνουν να επιδρούν σε βιολογικές παραμέτρους με τρόπο που ομοιάζει με “ταλαντωτική” συμπεριφορά ως προς την απόκριση της εκάστοτε παραμέτρου. Τα πιο ενδιαφέροντα και στατιστικώς σημαντικά ευρήματά μας προήλθαν από τη χορήγηση χαμηλών και υπεραραιών διαλυμάτων των δύο ευρέως χρησιμοποιούμενων χημειοθεραπευτικών ουσιών, σισπλατίνης και οξαλιπλατίνης, σε υγιείς και καρκινικές κυτταρικές σειρές. Οι χρωματομετρικές δοκιμασίες σουλφοροδαμίνης Β (δοκιμασία “SRB”) και 3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (δοκιμασία “ΜΤΤ”), και η δοκιμασία επίδρασης στο γενετικό υλικό με ηλεκτροφόρηση μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (δοκιμασία “Comet”) χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο κυτταρικών καλλιεργειών κατόπιν χορήγησης διαφόρων συνήθων, χαμηλών και υπεραραιών συγκεντρώσεων σισπλατίνης και οξαλιπλατίνης. Σε ορισμένες περιπτώσεις παρήχθη μια μη αναμενόμενη, στατιστικώς σημαντική “διφασικού” τύπου απόκριση με διαδοχικές κορυφές κυτταροπροστασίας και κυτταροτοξικότητας έναντι του μάρτυρα. Αυτό παρατηρήθηκε και όταν τα διαλύματα χορηγήθηκαν στα κύτταρα άνευ προευαισθητοποίησης αλλά και όταν προηγήθηκε επώαση με διαφορετική συγκέντρωση του ίδιου κυτταροτοξικού παράγοντα. Η παρατήρηση αυτή συνάδει με διάφορες αναφορές από τη βιβλιογραφία, σύμφωνα με τις οποίες οι χαμηλές και υπεραραιές συγκεντρώσεις τοξικών ουσιών αντιστρέφουν ή προστατεύουν έναντι της τοξικής επίδρασης μεγαλύτερων συγκεντρώσεων, ενώ συχνά αναφέρεται παρόμοια “διφασική” απόκριση με διαδοχικές υψηλές και χαμηλές κορυφές της βιολογικής παραμέτρου υπό μελέτη. Αυτό γενικά αποδίδεται σε φαινόμενα αρμονικού συντονισμού σε σχέση με την ευαισθησία βιολογικών συστημάτων προδιατεθειμένων ή προευαισθητοποιημένων προς την παράμετρο της συγκέντρωσης τοξικών ουσιών. Στη συζήτηση διευκρινίζουμε ζητήματα γύρω από την παρατηρούμενη “ταλαντωτική” συμπεριφορά και εντοπίζουμε σημεία προς μελλοντική διερεύνηση.