Παρασκευή προϊόντων κρέατος με νέες τεχνολογίες

Abstract

The aims of the present study were to investigate (a) the application of immobilized Lactobacillus casei ATCC 393 on wheat in the production of probiotic dry-fermented sausages, (b) the effect of sugar content and the initial concentration of immobilized L. casei on physicochemical and microbiological attributes of probiotic dry-fermented sausages (c) potential protective effects of both free and immobilized L. casei ATCC 393 on wheat grains against spoilage and pathogenic bacteria in probiotic dry-fermented sausages containing reduced or negligible amounts of curing salts (d) the effect of immobilized Lactobacillus casei ATCC 393 on wheat grains on the generation of volatile compounds in probiotic dry-fermented sausages during ripening and after mild heat treatment, (e) the effect of chemical preservatives, probiotic cultures and ripening time on the generation of volatile compounds in probiotic dry-fermented sausages during ripening and (f) the effect of cell immobilization on adhesion properties of lactobacilli to the Caco-2 monolayer. The goals were firstly to maintain survival of the probiotic strain at suitable levels for conferring the health benefits at the time of consumption (during production, ripening and after mild heat treatment), at a second stage to improve the quality characteristics of the new products and finally to extend the products’ shelf life. The physicochemical parameters of the novel probiotic dry-fermented sausages ranged in levels usually observed in dry-fermented sausages, except titratable acidity which was slightly increased. Although, overacidity caused by certain Lactobacillus strains used as starter cultures may result in sensory quality deterioration, such a trend was not obvious in our samples. The probiotic cultures resulted in significant increase of self-life and the resistance to spoilage was more prominent in samples containing immobilized cells. Spoilage was mainly due to white spots on the sausage surface and to white thin fibers in the interior attributed to yeasts/moulds overgrowth, resulting also in slight formation of off-odors and off-flavours, but the products were still acceptable. The extension of preservation time obtained in probiotic sausages compared to sausages produced with no culture supported our initial hypothesis for extending the shelf-life of the novel products and could be attributed to the higher titratable acidity and generally lower pH and aw recorded. While total aerobic counts and levels of lactobacilli and yeasts/moulds remained high during ripening, a drastic decrease was observed in enterobacteria, pseudomonads and staphylococci counts, which dropped to undetectable levels. Likewise, Clostridium spp. was not detected in any sample during the whole ripening period. Such reductions constitute an important observation related to the safety aspect of the products. Microbial diversity was further studied applying a PCR-DGGE protocol. Other species of Lactobacillus, Brochothrix thermosphacta and members of the genera Leuconostoc, Lactococcus, Carnobacterium and Bacillus were detected as the main bacterial populations. Noticeably, members of Rhodococcus, Saccharothrix or Micromonospora were only detected in sausages produced with no starter culture. Concerning the yeast/moulds ecology, Debaryomyces hansenii or Priceomyces carsonii and Candida zeylanoides or Schwanniomyces polymorphus, as well as members of Saccharomyces and Kluyveromyces dominated. Of note, Allium species, added during production as ground leek, was also identified. Microbiological and strain-specific multiplex PCR analysis confirmed that the levels of L. casei ATCC 393 in the samples at the end of ripening were above the minimum concentration for conferring a probiotic effect (≥6 log cfu/g). However, after heat treatment, our strain was detected in the above levels, only in sausages containing high content of immobilized cells. Generally, SPME GC/MS analysis showed an improved profile of volatile compounds in probiotic dry-fermented sausages containing immobilized L. casei ATCC 393 cells. Principal Component Analysis of the semi-quantitative data revealed that primarily the nature of the culture and concentration of the immobilized probiotic culture, as well as the ripening time affected the volatile composition. Likewise, the nature and the concentration of the starter culture affected significantly the volatile composition of dry-fermented sausages after mild heat treatment (70-72oC for 8-10min). In contrast, mainly the ripening process affected the volatile composition in sausages with reduced or negligible amounts of chemical preservatives. However, it is yet unknown and difficult to interpret the relationships between the microbial associations which are involved in the biochemical changes that occur during ripening of fermented sausages, the curing salts and the chemical compounds, due to the high complexity of the food ecosystem. Dry-fermented sausages are usually consumed raw or after mild heat treatment. Therefore, the sensory characteristics of the probiotic dry-fermented sausages produced with immobilized or free L. casei were compared to sausages produced without adjunct culture and to a similar type commercial product after heat treatment. All products containing the probiotic cultures were approved and accepted by the panel and the preliminary sensory test ascertained the fine taste and the overall high quality. Sugar addition affected significantly the appearance, while the nature of the starter culture had a significant effect on sausage aroma. Noticeably, the colour and overall acceptance were significantly affected by both factors. In contrast, no significant effect on product consistency was observed. Generally, sugar addition improved the appearance and colour, while the dry-fermented sausages produced using immobilized cells had a distinctive, characteristic aroma, which lasted until the end of the ripening period. As the addition of wheat grains may affect significantly product quality, the effect of the initial concentration of immobilized L. casei on the sensory characteristics was also investigated. Although the tasters showed a preference for the commercial product over sausages produced in the laboratory except I-300 concerning the aroma, no significant differences were observed for the rest sensory attributes. Of note, untreated sausages produced using immobilized cells had a distinctive, characteristic aroma, which lasted until the end of the ripening period. The results concerning the adhesion properties of L. casei ATCC 393 to Caco-2 cells showed high adhesion ability for free L. casei cells (1038 cfu adhered per 100 Caco-2 cells) compared to L. plantarum NCIMB strain which was used as control. Although cell immobilization resulted in a significant reduction of adhesion ability, it still remained in high levels compared to values reported in literature concerning free cells. Freeze-drying resulted in significant decrease of adhesion ability only in free and not in immobilized cells. L. casei ATCC 393 was characterized as relatively hydrophilic (22.70% adhesion to n-hexadecane) in contrast to L. plantarum NCIMB which was characterized hydrophobic (54.84% adhesion to n-hexadecane), while cell immobilization increased slightly hydrophobicity of L. casei ATCC 393. More importantly, cell immobilization enhanced the monolayer integrity leading to at least 2-fold increased TEER values compared to free cells. SEM micrographs ascertained adhesion of both immobilized and free cells to the brush border microvilli, as well as interaction of the starch granules and proteins of wheat grains (immobilization support) to the Caco-2 monolayer.

Οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής ήταν α) η αξιολόγηση των ακινητοποιημένων κυττάρων Lactobacillus casei ATCC 393 σε σιτάρι για την παραγωγή προβιοτικών ξηρών ζυμωμένων λουκάνικων, β) η διερεύνηση της επίδρασης της αρχικής συγκέντρωσης σακχάρου και της αρχικής συγκέντρωσης ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei στα φυσικοχημικά και μικροβιολογικά χαρακτηριστικά των προβιοτικών ξηρών ζυμωμένων λουκάνικων, γ) η διερεύνηση πιθανής προστατευτικής επίδρασης τόσο των ελεύθερων όσο και των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei ATCC 393 σε κόκκους σιταριού έναντι αλλοιωγόνων και παθογόνων βακτηρίων στα προβιοτικά ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα με χαμηλές ή μηδενικές συγκεντρώσεις νιτρωδών-νιτρικών αλάτων και NaCl, δ) η διερεύνηση της επίδρασης των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei ATCC 393 σε κόκκους σιταριού στην σύνθεση των πτητικών ενώσεων σε προβιοτικά ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα κατά την διάρκεια της ωρίμανσης και μετά από ήπια θερμική κατεργασία, ε) η διερεύνηση της επίδρασης των χημικών συντηρητικών, της προβιοτικής καλλιέργειας και του χρόνου ωρίμανσης στις πτητικές ενώσεις σε προβιοτικά ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα κατά την διάρκεια της ωρίμανσης και στ) η διερεύνηση της επίδρασης της ακινητοποίησης στην ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων L. casei ATCC 393 σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Ο σκοπός ήταν, πρώτον η επιβίωση του προβιοτικού στελέχους στα απαραίτητα επίπεδα για τα ευεργετικά οφέλη των προβιοτικών την στιγμή της κατανάλωσης (κατά την της παραγωγή, ωρίμανση και μετά από ήπια θερμική επεξεργασία), δεύτερον, η βελτίωση των ποιοτικών χαρακτηριστικών των νέων προϊόντων και τέλος η αύξηση του χρόνου συντήρησης. Τα αποτελέσματα των φυσικοχημικών αναλύσεων των νέων προβιοτικών ξηρών ζυμωμένων λουκάνικων κυμάνθηκαν σε επίπεδα που παρατηρούνται συνήθως σε ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα, εκτός της ογκομετρούμενης οξύτητας η οποία ήταν ελαφρώς αυξημένη. Παρά το γεγονός ότι η υπερβολική οξύτητα που προκαλείται από ορισμένα στελέχη Lactobacillus που χρησιμοποιούνται ως αρχική καλλιέργεια μπορεί να οδηγήσει σε υποβάθμιση της ποιότητας, κάτι τέτοιο δεν παρατηρήθηκε στα δείγματα της διατριβής. Η προσθήκη προβιοτικής καλλιέργειας οδήγησε σε σημαντική αύξηση του χρόνου συντήρησης, ενώ η προστατευτική δράση έναντι των αλλοιώσεων ήτανεμφανής στα δείγματα με ακινητοποιημένα κύτταρα. Η αλλοίωση οφειλόταν κυρίως σε λευκές κηλίδες στην επιφάνεια καθώς και σε λεπτές λευκές ίνες στο εσωτερικό των λουκάνικων, πιθανόν λόγω υπερανάπτυξης των ζυμών/μυκήτων, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό δυσάρεστων οσμών, αν και τα προϊόντα εξακολουθούσαν να είναι αποδεκτά κατά τον οργανοληπτικό έλεγχο. Η αύξηση του χρόνου συντήρησης των προβιοτικών λουκάνικων, συγκριτικά με λουκάνικα που παρασκευάστηκαν χωρίς αρχική καλλιέργεια, επιβεβαίωσε την αρχική υπόθεση για αύξηση του χρόνου συντήρησης, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην αυξημένη τιμή της ογκομετρούμενης οξύτητας και στις χαμηλές τιμές του pH και της ενεργότητας νερού (aw). Ενώ η ολική μεσόφιλη χλωρίδα, καθώς και τα επίπεδα λακτοβακίλλων και ζυμών/μυκήτων παρέμειναν σε υψηλά επίπεδα, παρατηρήθηκε δραστική μείωση στα επίπεδα των εντεροβακτηρίων, ψευδομονάδων και σταφυλόκοκκων, τα οποία κυμάνθηκαν σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Ομοίως, δεν ανιχνεύθηκε Clostridium spp. σε κανένα δείγμα καθ` όλη την χρονική διάρκεια της ωρίμανσης. Τα χαμηλά επίπεδα αποτελούν μια σημαντική παρατήρηση καθώς σχετίζονται με την ασφάλεια των προϊόντων. Η μικροβιακή χλωρίδα μελετήθηκε περαιτέρω με την τεχνική PCR-DGGE. Οι κύριοι βακτηριακοί πληθυσμοί που ανιχνεύθηκαν ανήκαν στο είδος Brochothrix thermosphacta και στα γένη Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Carnobacterium και Bacillus. Στα δείγματα χωρίς αρχική καλλιέργεια ανιχνεύθηκαν μέλη του Rhodococcus και Saccharothrix ή Micromonospora. Όσον αφορά τις ζύμες, κυριάρχησαν οι Debaryomyces hansenii ή Priceomyces carsonii και Candida zeylanoides ή Schwanniomyces polymorphus, καθώς και μέλη του Saccharomyces και Kluyveromyces. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε όλα τα δείγματα ανιχνεύθηκε το είδος Allium, που αφορά το τεμαχισμένο πράσο που προστέθηκε στην κρεατομάζα κατά την παρασκευή των λουκάνικων. Η μικροβιολογική ανάλυση και η muliplex PCR επιβεβαίωσε ότι τα επίπεδα του στελέχους L. casei ATCC 393 κατά το τέλος της ωρίμανσης των προβιοτικών προϊόντων κυμάνθηκαν πάνω από την ελάχιστη συγκέντρωση (≥6 log cfu/g) που απαιτείται για την προβιοτική δράση. Σε γενικές γραμμές, παρατηρήθηκε βελτιωμένο προφίλ πτητικών ενώσεων στα ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei ATCC 393. Η PCA ανάλυση των πειραματικών δεδομένων έδειξε ότι κυρίως η φύση και η συγκέντρωση της αρχικής καλλιέργειας, αλλά και ο χρόνος της ωρίμανσης επηρέασαν σημαντικά την σύνθεση των πτητικών ενώσεων. Παρομοίως, η φύση και η συγκέντρωση της αρχικής καλλιέργειας επηρέασαν σημαντικά τις πτητικές ενώσεις στα ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα μετά από ήπια θερμική επεξεργασία (70-72oC για 8-10min). Αντίθετα, ο χρόνος της ωρίμανσης επηρέασαν κυρίως τις πτητικές ενώσεις στα λουκάνικα με χαμηλές ή μηδενικές συγκεντρώσεις νιτρωδών-νιτρικών αλάτων και NaCl. Όμως, είναι ακόμα άγνωστο και δύσκολο να ερμηνευτούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μικροβιακών πληθυσμών που ευθύνονται για τις βιοχημικές μεταβολές, των χημικών συντηρητικών και των πτητικών ενώσεων, λόγω της πολυπλοκότητας του μικροβιακού οικοσυστήματος των τροφίμων.Τα ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα συνήθως καταναλώνονται ωμά ή μετά από ήπια θερμική επεξεργασία. Tα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των προβιοτικών ξηρών ζυμωμένων λουκάνικων που παρασκευάστηκαν με προσθήκη ακινητοποιημένων και ελεύθερων κυττάρων L. casei, συγκρίθηκαν με λουκάνικα χωρίς αρχική καλλιέργεια,, καθώς και με παρόμοια εμπορικά προϊόντα μετά από θερμική επεξεργασία. Τα ξηρά ζυμωμένα λουκάνικα με ακινητοποιημένα κύτταρα L. casei ATCC 393 έγιναν αποδεκτά από το πάνελ και ο προκαταρκτικός οργανοληπτικός έλεγχος επιβεβαίωσε την υπέροχη γεύση και την άριστη ποιότητα των νέων προϊόντων. Η προσθήκη σακχάρου επηρέασε σημαντικά την εμφάνιση του προϊόντος, ενώ η αρχική καλλιέργεια επηρέασε σημαντικά το άρωμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι και οι δύο παράγοντες επηρέασαν σημαντικά το χρώμα και την συνολική αποδοχή. Αντιθέτως, δεν επηρεάστηκε σημαντικά η συνεκτικότητα του προϊόντος. Σε γενικές γραμμές, η προσθήκη σακχάρου βελτίωσε την εμφάνιση και το χρώμα, ενώ τα λουκάνικα με ακινητοποιημένα κύτταρα είχαν ένα ξεχωριστό, χαρακτηριστικό άρωμα, το οποίο διήρκησε μέχρι το τέλος της ωρίμανσης. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, δεδομένου ότι η προσθήκη κόκκων σιταριού μπορεί να επηρεάσει την ποιότητα του προϊόντος. Αν και οι δοκιμαστές έδειξαν μια προτίμηση για το εμπορικό προϊόν σε σχέση με τα λουκάνικα που παρασκευάστηκαν στο εργαστήριο, πλην του δείγματος Ι-300 όσον αφορά το άρωμα, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα υπόλοιπα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα λουκάνικα με ακινητοποιημένα κύτταρα είχαν ένα ξεχωριστό, χαρακτηριστικό άρωμα, το οποίο διήρκησε μέχρι το τέλος της ωρίμανσής τους.Όσον αφορά τις ιδιότητες προσκόλλησης, παρατηρήθηκε μεγάλος αριθμός προσκολλημένων ελεύθερων κύτταρων L. casei σε μονοστοιβάδα από Caco-2 κύτταρα (1038 cfu προσκολλημένων ανά 100 Caco-2 κύτταρα) συγκριτικά με τα κύτταρα L. plantarum NCIMB που χρησιμοποιήθηκαν ως control καθώς είναι γνωστό για την μεγάλη ικανότητα προσκόλλησης. Μολονότι η ακινητοποίηση οδήγησε σε σημαντική μείωση της ικανότητας προσκόλλησης, τα προσκολλημένα κύτταρα κυμάνθηκαν σε υψηλά επίπεδα σε σύγκριση με τις τιμές που αναφέρονται στη βιβλιογραφία σχετικά με τα ελεύθερα κύτταρα. Η λυοφιλίωση οδήγησε σε σημαντική μείωση της ικανότητας προσκόλλησης μόνο στα ελεύθερα και όχι στα ακινητοποιημένα κύτταρα. Το στέλεχος L. casei ATCC 393 χαρακτηρίστηκε ως σχετικά υδρόφιλο (22.70% προσκόλληση σε n-δεκαεξάνιο) σε αντίθεση με το στέλεχος L. plantarum NCIMB που χαρακτηρίστηκε ως υδρόφοβο (54.84% προσκόλληση σε n-δεκαεξάνιο), ενώ η ακινητοποίηση των κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα την ελαφρά αύξηση της υδροφοβικότητας στο στέλεχος L. casei ΑΤCC 393. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ακινητοποιημένα κύτταρα οδήγησαν σε αύξηση της διαδερµικής ηλεκτρικής αντίστασης (Trans-Epithelial Electrical Resistance, TEER) κατά τουλάχιστον 2 φορές σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Οι φωτογραφίες από το Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Σάρωσης επιβεβαίωσαν την προσκόλληση τόσο των ελεύθερων όσο και των ακινητοποιημένων κυττάρων L. casei ATCC 393 στις μικρολάχνες, καθώς επίσης και την αλληλεπίδραση των αμυλόκοκκων και των πρωτεϊνών του σιταριού (υπόστρωμα ακινητοποίησης) με την Caco-2 μονοστοιβάδα.