Μορφολογική μελέτη της έκφρασης του οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), συν-ρυθμιστών της μεταγραφής και πιθανών δεικτών καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους εγκεφάλου: μια συστημική προσέγγιση

Abstract

Astrocytic tumors are the most common primary neoplasms of the central nervous system (CNS) and have traditionally been associated with disappointing clinical outcomes. The current challenge is to develop more efficacious and targeted therapeutic paradigms, exploiting the knowledge derived from the systems approach of understanding the complex networks underlying tumor formation and progression. Estrogen receptor beta (ERβ) and co-regulators of transcription AIB1, TIF2 and PELP1, are key components of complex cellular networks and integrate diverse signaling afferents with transcription programs controlling various physiological cellular processes and a variety of disease states including cancer. SOX2 and EZH2 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. Elucidating the behavior of this particular network in cancer and its role in the formation of putative cancer stem cells is considered essential for the understanding of cancer as an adaptive complex system and subsequently allowing the discovery of more successful therapeutic designs. Purpose. In the context of the systems approach of comprehending tumorigenesis in astrocytomas, we sought to investigate the expression of ERβ and co – regulatory proteins AIB1, TIF1 and PELP1, as well as parallel expression of SOX2 and EZH2 in astrocytomas of various grades, and correlate the protein expression profiles with clinicopathological parameters and patients’ prognosis. Materials and methods. Expression of ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 and SOX2 was evaluated in 86 cases of astrocytic tumors, using Immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Twenty grade II astrocytomas, 22 grade III anaplastic astrocytomas and 46 grade IV glioblastomas multiform (GBM) were included in this study. Polymer based technique (Envision, Dako, CA, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Bio care Medical, CA, USA) and primary antibodies against ERβ1 (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) and SOX2 (R&D Systems, Inc.) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Representative areas were selected at low power (x100) magnification. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). The level of significance was set at p-value <0.05. Results. ERβ levels were significantly decreased with the progression of tumors’ grade. High expression of ERβ was an independent favorable prognostic factor on multivariate analysis. Expression of AIB1, TIF2 and PELP1, was not correlated to ERβ expression and followed an opposite trend, with increasing levels in grade III and IV relative to grade II tumors. Univariate survival analysis revealed that high AIB1, TIF2 and PELP1 expression was associated with worse prognosis. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 and SOX2 in high grade III and IV astrocytomas, compared to low grade II astrocytomas. Strong correlation between EZH2 and SOX2 was also detected within all subgroups according to grade. Kaplan-Meier showed that EZH2 and SOX2 high expression was predictive of worse overall survival in the whole cohort as well as after subgroup analysis by grade. Finally, multivariate Cox analysis that included age, gender, grade, and expression of both proteins, revealed that high EZH2 together with higher grade were strong negative prognostic factors. Conclusions. ERβ, AIB1, TIF2 and PELP1 appear to play an important role in the pathogenesis of astrocytic tumors, with ERβ exhibiting a protective effect, whereas AIB1, TIF2 and PELP1 facilitate malignant progression. AIB1, TIF2 και PELP1 contribution in tumor progression is speculated to be achieved through ERβ independent pathways. Moreover, the expression status of ERβ, by distinguish patient subpopulations with different prognosis within the same grade, could be a useful tool accommodating personalized clinical decision-making. EZH2 and SOX2 may serve as potential cancer stem cell markers in astrocytomas and as such help optimizing diagnostic and prognostic assessments and devising novel individually tailored treatment strategies.

Εισαγωγή. Τα αστροκυττώματα αποτελούν το συχνότερο τύπο πρωτοπαθών όγκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και παραδοσιακά θεωρούνται ότι σχετίζονται με ιδιαίτερα δυσμενή πρόγνωση. Η Συστημική προσέγγιση της καρκινογένεσης, εστιάζοντας στην αποκρυπτογράφηση του τρόπου λειτουργίας και δυναμικής αλληλεπίδρασης πολύπλοκων παθοβιολογικών δικτύων, προσφέρει σήμερα καινούριες ερευνητικές προοπτικές και πιθανές εναλλακτικές, περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές. Οι οιστρογονικοί υποδοχείς και οι συν-ρυθμιστές της μεταγραφής συνιστούν κομβικά σημεία “συνομιλίας” (cross-talk) πολύπλοκων μοριακών οδών του κυττάρου, διαμεσολαβώντας πλήθος κυτταρικών λειτουργιών φυσιολογικά αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες και ο καρκίνος. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2 θεωρούνται μόρια κλειδιά του ρυθμιστικού μεταγραφικού κυκλώματος που χαρακτηρίζει το stemness. Η αποσαφήνιση της συμπεριφοράς του συγκεκριμένου αυτού δικτύου στα διάφορα νεοπλάσματα και ρόλος του σε σχέση με την απόκτηση ιδιότητας καρκινικού stem κυττάρου, θεωρείται καθοριστικής σημασίας στην προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου του καρκίνου ως πολύπλοκο προσαρμόσιμο σύστημα, που θα αναδείξει εναλλακτικούς θεραπευτικούς στόχους και θα επιτρέψει περισσότερο αποτελεσματικές σε σχέση με τις υπάρχουσες παρεμβάσεις. Σκοπός. Υπό το πρίσμα της Συστημικής προσέγγισης της κατανόησης της κακοήθους ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τα επίπεδα έκφρασης του Οιστρογονικού υποδοχέα β (ERβ), και των συν-ρυθμιστών AIB1, TIF2 and PELP1, όπως και την έκφραση των παραγόντων EZH2 και SOX2 σε αστροκυττώματα grade II ως IV και τη συσχέτιση μεταξύ του προφίλ έκφρασης των συγκεκριμένων παραγόντων, με κλινικοπαθολογικά δεδομένα. Υλικό και μέθοδος. Η έκφραση των πρωτεϊνών ERβ, AIB1, TIF2, PELP1, EZH2 και SOX2 εκτιμήθηκε σε 86 περιπτώσεις αστροκυτταρικών όγκων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Είκοσι grade II αστροκυττώματα, 22 grade III αναπλαστικά αστροκυττώματα και 46 grade IV πλειόμορφα γλοιοβλαστώματα (GBM) συμπεριλήφθησαν στη συγκεκριμένη μελέτη. Η μέθοδος με χρήση συστήματος ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, CA, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, CA, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των ERβ (Biogenex, CA, USA), AIB1 (BD Biosciences, Ca, USA), TIF2 (BD Biosciences, Ca, USA), PELP-1/MNAR (Novus Biologicals, CO, USA) EZH2 (Novocastra, UK) και SOX2 (R&D Systems, Inc.) χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Σε κάθε περιστατικό και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση. Αντιπροσωπευτικές περιοχές επιλέχθηκαν κατόπιν σάρωσης του πλακιδίου σε οπτικό πεδίο μικρής μεγέθυνσης (Χ100), ενώ η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 17.0, Chicago, IL, USA). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα. Σημαντική μείωση των επιπέδων του ERβ παρατηρήθηκε παράλληλα με την αύξηση του grade. Επιπλέον, η υψηλή ERβ έκφραση αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός παράγοντας της συνολικής επιβίωσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η έκφραση των AIB1, TIF2 και PELP1, δε συσχετίσθηκε με αυτή του ERβ, και ακολούθησε αντιστρόφως ανοδική τάση, παράλληλα με την αύξηση του grade. Η στατιστική ανάλυση περαιτέρω, ανέδειξε μία σημαντική αύξηση τόσο των επιπέδων EZH2 όσο και SOX2 στα grade III και IV σε σχέση με τα grade II αστροκυττώματα. Ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση των δύο δεικτών σε όλες τις κατά grade υποομάδες. Η Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι, η υψηλή EZH2 και SOX2 πρωτεϊνική έκφραση συνιστούν αρνητικό παράγοντα πρόγνωσης τόσο στο σύνολο των ασθενών όσο και κατόπιν διαστρωμάτωσης κατά grade. Τέλος, η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση συνυπολογίζοντας την ηλικία, το φύλο, το grade και την έκφραση των δύο πρωτεϊνών έδειξε ότι μόνο η υψηλή EZH2 έκφραση μαζί με το υψηλό grade, αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες δυσμενούς πρόγνωσης. Συμπεράσματα. Οι παράγοντες ERβ, AIB1, TIF2 και PELP1 ενέχονται στους παθογενετικούς μηχανισμούς ανάπτυξης και εξέλιξης των αστροκυτταρικών όγκων, με τον ERβ να διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο και τους AIB1, TIF2 και PELP1 να εμφανίζουν όγκο-προαγωγό δράση. Το ογκογενετικό δυναμικό των παραγόντων AIB1, TIF2 και PELP1 φαίνεται πως διαμεσολαβείται μέσω ανεξάρτητων του οιστρογονικού υποδοχέα μηχανισμών. Η έκφραση του ERβ, διαχωρίζοντας κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς ιδίου grade, θα μπορούσε να αποτελέσει ένα χρήσιμο εργαλείο κατά τη λήψη εξατομικευμένων κλινικών αποφάσεων. Οι παράγοντες EZH2 και SOX2, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εν δυνάμει δείκτες καρκινικών stem κυττάρων σε αστροκυτταρικούς όγκους, να βοηθήσουν τη βελτιστοποίηση τόσο διαγνωστικών όσο και προγνωστικών διαδικασιών στην κλινική πράξη, και να κατευθύνουν την ανάπτυξη εξατομικευμένων στρατηγικών θεραπείας.