Μελέτη του ομοδιμερισμού της πρωτεΐνης bri2

Abstract

BRI2 is a protein involved in Familial British Dementia (FBD) and Familial Danish Dementia (FDD), since patients with those dementias bear mutations in the gene that encodes for BRI2. Both diseases are characterized by progressive dementia and result in death. FBD and FDD present striking neuropathological similarities with Alzhemer’s disease (AD). Among those similarities is the deposition of amyloid peptides in the brains of patients. In FBD/FDD the peptides are produced after the proteolytic processing of the mutated forms of BRI2. In AD the peptide deposited is Aβ, and is derived from the proteolytic processing of the Amyloid Precursor Protein (APP). BRI2 physiological role remains elusive. Ηowever, there are studies that attribute different functions to BRI2. For example, we showed previously that BRI2 interacts with APP and reduces its proteolysis, as well as Aβ production. In an attempt to approach the physiological role of BRI2, we examined the possibility that it homodimerizes. Two structural features in the primary structure of BRI2 led us to hypothesize that it could homodimerize. First, BRI2 contains in its transmembrane domain the GXXXG motif that has been implicated in the homodimerization of transmembrane proteins. In addition, BRI2 contains in its extracellular sequence one free cysteine residue 89 (C89) that could mediate the association of two BRI2 molecules through an intermolecular disulfide bond. Based on the above, we showed that in cell lines expressing two BRI2 proteins tagged with different epitope tags, two BRI2 molecules interact. In addition, we directly detected the homodimers in cells using the BiFC assay (Bimolecular Fluorescence Complementation). Endogenous BRI2 in mouse brain extracts also forms homodimers. Subsequently, the involvement of the GXXXG motif in BRI2 homodimerization was examined. Mutation of glycine to leucine residues, and immunoprecipitation experiments, indicated that mutation of the motif does not inhibit homodimerization. To investigate whether BRI2 homodimerizes with the involvement of disulfide bonds, we expressed BRI2 in cells and performed Western Blot analysis of the cell extracts under non-reducing conditions. Under these conditions, we detected monomers as well as homodimers in double the molecular weight of the monomer. Mutation of cysteine indicated that it is responsible for the formation of the intermolecular disulfide bonds formed between two BRI2 molecules. Apart from disulfide bonds non-covalent interactions were shown to participate in the homodimerization. To identify the responsible region for those interactions we created BRI2 constructs that bear certain deletions and a mutation in C89. Using the corresponding mutated proteins we showed that non-covalent interactions exist within the sequence after aminoacid 107. In addition, we showed that BRI2 homodimers are formed in the ER and that BRI2 exists at the cell surface as a homodimer. Finally, we showed that homodimerization is a prerequisite for BRI2 interaction with APP.

Η BRI2 είναι μια πρωτεΐνη που παίζει κεντρικό ρόλο στις οικογενείς άνοιες βρετανικού και δανέζικου τύπου, καθώς ασθενείς με αυτές τις άνοιες εκφράζουν μεταλλαγμένες μορφές της πρωτεΐνης. Και οι δύο ασθένειες χαρακτηρίζονται από προοδευτική άνοια και παρεγκεφαλιδική αταξία και καταλήγουν στο θάνατο. Oι παραπάνω άνοιες εμφανίζουν, νευροπαθολογικά, εντυπωσιακές ομοιότητες με την πιο κοινή μορφή άνοιας, τη νόσο Alzheimer. Ανάμεσα σε αυτές τις ομοιότητες περιλαμβάνεται η παρουσία αμυλοειδών συσσωματώσεων στον εγκέφαλο των ασθενών. Η BRI2 έχει άγνωστο φυσιολογικό ρόλο, παρόλο που έχουν διεξαχθεί μελέτες που αποδίδουν σε αυτή διάφορες λειτουργίες. Για παράδειγμα, μελέτες του εργαστηρίου μας έδειξαν ότι η BRI2 αλληλεπιδρά με την ΑΡΡ και μειώνει την πρωτεόλυσή της, καθώς και την παραγωγή του πεπτιδίου Αβ. Στην παρούσα εργασία προκειμένου να προσεγγιστούν οι φυσιολογικές ιδιότητες της πρωτεΐνης BRI2, εξετάστηκε η πιθανότητα να ομοδιμερίζεται. Στην υπόθεση αυτή οδηγηθήκαμε από την παρουσία δύο χαρακτηριστικών στην πρωτοταγή δομή της πρωτεΐνης. Καταρχήν, η BRI2 περιέχει διαμεμβρανικά το μοτίβο GXXXG, το οποίο εμπλέκεται στον ομοδιμερισμό διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Επιπλέον, η περιέχει στην εξωκυτταροπλασματική της ακολουθία ένα εξωκυτταροπλασματικό κυστεϊνικό κατάλοιπο, αυτό στη θέση 89, το οποίο είναι ελεύθερο και θα μπορούσε να διαμεσολαβεί στη σύνδεση δύο μορίων BRI2 μέσω διαμοριακού δισουλφιδικού δεσμού. Με βάση τα παραπάνω δεδομένα δείχθηκε ότι σε κυτταρικές σειρές που εξέφραζαν πρωτεΐνες BRI2 που έφεραν δύο διαφορετικούς αντιγονικούς επιτόπους, δύο μόρια της BRI2 αλληλεπιδρούν. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν απευθείας τα ομοδιμερή σε κύτταρα με τη μέθοδο BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation). Επιπρόσθετα, η ενδογενής BRI2 ανιχνεύτηκε ως ομοδιμερές σε εκχυλίσματα εγκεφάλου ποντικού. Στη συνέχεια, εξετάστηκε η συμμετοχή του μοτίβου GXXXG στον ομοδιμερισμό. Μεταλλαγή των γλυκινών του μοτίβου σε κατάλοιπα λευκίνης, και πειράματα ανοσοκατακρήμνισης, έδειξαν ότι η μεταλλαγή του μοτίβου δεν εμποδίζει τον ομοδιμερισμό. Για να διερευνηθεί αν η BRI2 ομοδιμερίζεται μέσω δισουλφιδικών δεσμών, εκφράστηκε η πρωτεΐνη σε κύτταρα και έγινε ανάλυση των κυτταρικών εκχυλισμάτων κατά Western σε μη αναγωγικές συνθήκες. Κάτω από αυτές τις συνθήκες ανιχνεύθηκαν μονομερή και ομοδιμερή της BRI2, σε μοριακή μάζα διπλάσια από αυτή του μονομερούς. Μεταλλαγή στην κυστεΐνη 89 σε αλανίνη έδειξε ότι η κυστεΐνη αυτή είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία διαμοριακού δισουλφιδικού δεσμού ανάμεσα σε δύο μόρια BRI2. Εκτός από τους δισουλφιδικούς δεσμούς δείχθηκε ότι συμμετέχουν μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις στον ομοδιμερισμό. Ακολούθως, δημιουργήθηκαν μοριακές κατασκευές της BRI2 που έφεραν μεταλλαγή στην τριπλέτα που κωδικοποιεί για την κυστεΐνη 89, καθώς και διάφορες ελλείψεις σε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες. Πειράματα με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες έδειξαν ότι οι μη ομοιπολικές αλληλεπιδράσεις που συγκρατούν τα ομοδιμερή της BRI2 βρίσκονται στην ακολουθία μετά το αμινοξύ 107. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο υποκυτταρικός εντοπισμός των ομοδιμερών. Βρέθηκε ότι τα ομοδιμερή σχηματίζονται στο ΕΔ και ότι η BRI2 εμφανίζεται στην κυτταρική επιφάνεια κυρίως ως ομοδιμερές. Τέλος, δείχθηκε ότι ο ομοδιμερισμός είναι σημαντικός για την αλληλεπίδραση της BRI2 με την ΑΡΡ.