Συνθήκες παραγωγής σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών Α και C στα ελληνικά παραδοσιακά τυριά κασέρι και κεφαλοτύρι

Abstract

Kaseri is a traditional Greek semi-hard pasta filata-type cheese of Protected Designation of Origin and is produced either from ewe's milk or from a mixture of ewe's and goat's milk. Its manufacturing technology involves melting of the acidified (pΗ 5.2) cheese mass ("baski") at 75-78°C, kneading and molding it so as to become an elastic mass, which ripens for at least 3 months. Kefalotiri is a traditional Greek hard cheese which is produced either from ewe's milk or from cow's milk or from a mixture of them. Kefalotyri also ripens for at least 3 months.In the present work, pasteurized ewe's milk was inoculated with starter culture and different populations (103, 104, 105 or 106 cfu/ml) of Staphylococcus aureus strains 264 and 137, which produce the enterotoxins Α and C, respectively. Following the addition of lactic acid bacteria (LAB) as a starter culture (a mixture of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus or each LAB bacterium alone) the milk was coagulated with rennet and processed to Kaseri or Kefalotiri cheese. The traditional technology dictated by the Greek Food and Beverages Code was followed. Throughout the whole ripening period, the cheeses were examined for numbers of S. aureus, enterotoxin production, levels of LAB as well as for physicochemical parameters.S. aureus was able to multiply and produce enterotoxins only during the early stages of curd formation when the pH was > 5.2 (first 3 days) and only when the initial inoculum was ? 105 cfu/ml of milk. Enterotoxins were detected only when the S. aureus populations exceeded 6.9 and 6.6 log cfu/g for strains 137 and 264, respectively. For the detection of enterotoxins the Transia Plate Staphylococcal Enterotoxins commercial kit was used. The detection limit of the method was estimated to be 1 ng/g or ml. During the melting stage (75°- 76°C/15 min) of "baski", the populations of S. aureus decreased by 5-6 log cfu/g, while the enterotoxin, if present in the "baski" cheese curd, was washed away with the hot wash-water by more than 80%. Thus, although in some "baski" samples enterotoxins were detected at high concentrations, melting and kneading of the cheese curd resulted in the decrease of the enterotoxin concentrations to non detectable levels. Detectable concentrations of enterotoxins in Kaseri cheese were found only when their respective levels in "baski" were higher than 8.2 ng/g for enterotoxin Α and 6.7 ng/g for enterotoxin C. During ripening and storage of Kaseri cheese the populations of S. aureus continued to decrease, reaching less than 10 cfu/g of cheese by the end of the 3 months of ripening. During the melting stage (75°- 76°C/15 min) of "baski", the populations of LAB decreased by 1-2 log cfu/g. Nevertheless, their populations were > 6.5 log cfu/g throughout the 3-month ripening period.The populations of S. aureus increased during the first 6 h of Kefalotiri cheesemaking when the pH was > 5.3, remained stable for 48 h and then started to decline. Growth of S. aureus was faster and its survival in the cheese was longer when the starter culture activity was not satisfactory. Enterotoxin Α or C was produced in the cheese curd when the initial inoculum of S. aureus in milk was 106 cfu/ml, but in experiments with sub-optimal starter activity, enterotoxin was produced even with initial inocula of 104 and 105 cfu/ml of milk. Enterotoxins were detected only when the S. aureus populations exceeded 7.0 and 6.9 log cfu/g for strains 137 and 264, respectively. Unless toxin was produced in Kefalotiri cheese within the first 48 h of cheese manufacture, enterotoxin production was unlikely to occur at a later stage. However, once the enterotoxin was produced it persisted during cheese storage even though the populations of S. aureus were continuously decreasing, reaching levels of <10 cfu/g after 3 months of ripening. LAB reached high populations by the 6th hour of Kefalotiri cheesemaking and started to decline slowly after the 12th day of ripening. Nevertheless, high populations of LAB (> 7.4 log cfu/g) were enumerated even after the end of the 3-month ripening period.

Διερευνήθηκαν οι συνθήκες παραγωγής σταφυλοκοκκικών εντεροτοξινών Α και C, στα τυριά Κασέρι και Κεφαλοτύρι. Το Κασέρι ανήκει στην κατηγορία των τυριών τύπου pasta filata, δηλαδή υφίσταται τήξη της όξινης (pH = 5,2) τυρομάζας του μπασκιού στους 75-78οC, ζύμωση και μάλαξη ώστε να μετατραπεί σε ελαστική μάζα που ωριμάζει για 3 μήνες. Το Κεφαλοτύρι είναι παραδοσιακό σκληρό Ελληνικό τυρί που παρασκευάζεται από πρόβειο ή/και αγελαδινό γάλα και ωριμάζει επίσης για 3 μήνες.Πρόβειο γάλα που ήταν παστεριωμένο και τυποποιημένο για Κασέρι, ενοφθαλμιζόταν με οξυγαλακτική καλλιέργεια από μίγμα των στελεχών Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus και Streptococcus thermophilus σε αναλογία 0,2%, έκαστον ή με μονοδύναμη καλλιέργεια σε αναλογία 0,4% ενός από τα ανωτέρω βακτήρια. Στο ενοφθαλμισμένο με οξυγαλακτική καλλιέργεια γάλα γινόταν ενοφθαλμισμός με τα στελέχη Staphylococcus aureus 137 (παραγωγή εντεροτοξίνης C) και S. aureus 264 (παραγωγή εντεροτοξίνης Α), σε πληθυσμούς της τάξεως των 103, 104, 105 ή 106 cfu/ml γάλακτος. Ακολουθήθηκε η παραδοσιακή τεχνολογία παραγωγής Κασεριού και το παραγόμενο τυρί εξεταζόταν σε προκαθορισμένα διαστήματα για τον πληθυσμό του S. aureus και την παραγωγή εντεροτοξίνης.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο S. aureus μπορούσε να αναπτυχθεί μόνο κατά την πρώτη φάση παραγωγής του τυριού (τυρόπηγμα – μπασκί). Τοξίνη ανιχνεύθηκε όταν ο πληθυσμός των σταφυλοκόκκων υπερέβη τους 6,9 και 6,6 log cfu/g τυροπήγματος ή μπασκιού για τον S. aureus 137 και τον S. aureus 264, αντίστοιχα και μόνο όταν το αρχικό ενοφθάλμισμα στο γάλα ήταν τουλάχιστον της τάξεως των 1x105 cfu/ml. Η ευαισθησία της μεθόδου ανίχνευσης εντεροτοξίνης ήταν 1 ng/g. Κατά τη θερμική επεξεργασία (75 – 76οC/15 min) του μπασκιού για μετατροπή του σε Κασέρι, οι πληθυσμοί του S. aureus μειώνονταν κατά 5 - 6 log cfu/g, ενώ η εντεροτοξίνη διέφευγε κατά το μεγαλύτερο ποσοστό (> 80%) στο νερό τήξης της τυρομάζας. Έτσι μολονότι σε ορισμένα δείγματα μπασκιού ανιχνεύονταν υψηλές συγκεντρώσεις εντεροτοξίνης μετά την τήξη της τυρομάζας, τα δείγματα που εξετάσθηκαν είχαν μη ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις. Ανιχνεύσιμες συγκεντρώσεις εντεροτοξίνης στο τελικό προϊόν διαπιστώθηκαν μόνο όταν η συγκέντρωσή της στο μπασκί ήταν μεγαλύτερη από 8,2 ng/g για την εντεροτοξίνη Α και 6,7 ng/g για την εντεροτοξίνη C. Οι σταφυλόκοκκοι που επιβίωναν κατά τη διαδικασία μετατροπής του μπασκιού σε Κασέρι, δεν πολλαπλασιάζονταν, αλλά αντίθετα μειώνονταν σε πληθυσμούς < 10 cfu/g εντός 3 – 4 μηνών. Κατά τη θερμική επεξεργασία (75 – 76οC/15 min) του μπασκιού για μετατροπή του σε Κασέρι οι πληθυσμοί των οξυγαλακτικών βακτηρίων μειώνονταν κατά 1 - 2 log cfu/g. Παρόλα αυτά οι πληθυσμοί διατηρούνταν σε επίπεδα > 6,5 log cfu/g καθόλη τη διάρκεια της τρίμηνης ωρίμανσης του τυριού.Στους πειραματισμούς για το τυρί Κεφαλοτύρι, χρησιμοποιήθηκε επίσης πρόβειο παστεριωμένο γάλα και ακολουθήθηκε η ίδια μεθοδολογία ως προς την οξυγαλακτική καλλιέργεια και τον ενοφθαλμισμό του γάλακτος με τα στελέχη S. aureus. Παρακολουθήθηκε η πορεία ανάπτυξης των στελεχών S. aureus και η παραγωγή εντεροτοξίνης από τη στιγμή της πήξεως έως το τέλος της ωρίμανσης (3 μήνες). Διαπιστώθηκε ότι οι πληθυσμοί του S. aureus αυξάνονταν κατά το πρώτο 6ωρο μετά την πήξη, σταθεροποιούνταν έως την 48η ώρα και στη συνέχεια άρχιζε η μείωσή τους. Η ανάπτυξη του S. aureus ήταν εντονότερη και η επιβίωση μεγαλύτερη όταν η δραστηριότητα της οξυγαλακτικής χλωρίδας ήταν μειωμένη και η πτώση του pH καθυστερούσε.Εντεροτοξίνη Α και C παρήχθη και ήταν ανιχνεύσιμη στο τυρί όταν ο αρχικός πληθυσμός του S. aureus ήταν της τάξεως του 106 cfu/ml γάλακτος. Σε περιπτώσεις όμως μειωμένης δραστηριότητας της οξυγαλακτικής χλωρίδας, ανιχνεύθηκε τοξίνη και με αρχικά ενοφθαλμίσματα S. aureus της τάξης του 104 και 105 cfu/ml γάλακτος. Μετά την παραγωγή τους οι εντεροτοξίνες εξακολουθούσαν να ανιχνεύονται στο Κεφαλοτύρι παρά το γεγονός ότι οι πληθυσμοί του S. aureus παρουσίαζαν σταδιακή μείωση που σε μερικούς πειραματισμούς έφθασε σε επίπεδα < 10 cfu/g τυριού. Εάν δεν παραγόταν εντεροτοξίνη κατά τις πρώτες 48 ώρες της παρασκευής του τυριού, αυτή δεν ήταν δυνατόν να παραχθεί σε επόμενα στάδια.