Επίπεδα κυτταροκινών στο υπερκείμενο των μέσων καλλιέργειας εμβρύων που αναπτύχθηκαν σε αυτόλογες συνκαλλιέργειες ενδομητριακών κυττάρων: συσχετισμός με το αποτέλεσμα μετά την εφαρμογή θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποιήσεως

Abstract

Objective: Co-culture of embryos with monolayers of autologous endometrial co-culture (AECC) has been shown to improve outcome for patients with multiple implantation failures after IVF. Presumably, this effect is mediated through the production of trophic factors expressed by these helper cell lines. The endometrial cells elaborate cytokines and growth factors. In laboratory animals, cytokine and growth factor expression by endometrial cells has been demonstrated to correlate with embryonic development. The specific aim of this study was to evaluate the effect of AECC on embryo quality and IVF outcome in patients with multiple implantation failures and correlate results with cytokine levels as measured in the supernatants of conditioned media (CM) of embryos grown in AECC.Study Design: Prospective controlled systematic study.Materials and Methods: Three-hundred and seventy-three patients with a mean age of37.3 ±3.9 years and a history of 3.0 ± 1.8 IVF failures were prospectively enrolled in this study. All patients underwent endometrial biopsy in the luteal phase (at least 5 days after LH surge) of a non-medicated cycle prior to their IVF attempt. Glandular (G) and stromal (S) endometrial cells were isolated by enzymatic digestion and separated based on differential sedimentation rates. These cells were cultured to confluence, released and then cryopreserved until the patient’s IVF cycle. All patients were then treated with standard ovulation induction protocols for IVF. Following oocyte retrieval and fertilization, all embryos were randomly allocated to growth on AECC or conventional media if more than 6 oocytes normally fertilized. Otherwise, all embryos were grown on AECC. At embryo transfer, conditioned media from the AECC cells exposed or non- exposed to human embryos were collected and assayed for the presence of interleukins (IL-2, IL-3, IL-4, IL-4sR, IL-5, IL-6, IL-10, IL-1S), growth factors [fibroblast growth factor basic (FGFb), insulin-like growth factor-I (IGF-I), insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3), transforming growth factor beta 2 (TGF-ß2), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB)], adhesion molecules [soluble L-Selectin (sL-Selectin), soluble E-Cadherin (sE-Cadherin), soluble Intercellular Adhesion Molecule-1 (sICAM- m, and apoptotic signals [soluble Fas (sFAS), Fas Ligand (FasL)] and correlated with outcome. Background levels of these factors were also determined from media alone (C-2 media supplemented with 15% patient’s serum). Levels of these factors were determined by means of a commercial quantitative sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Statistics included Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney U test and Chi- square.Results: A total of 10.6 ± 4.8 mean oocytes were obtained at retrieval, and on average 3.6 ± 1.2 embryos were replaced. The overall pregnancy rate was 55.5%, the clinical pregnancy rate (fetal heart activity) was 46.1%, and the implantation rate was 16.1%. On day 3 after retrieval, embryos grown on AECC were of higher quality (more blastomeres and less fragmentation) than embryos grown in conventional media without AECC (5.7 ±1.3 vs. 5.2 ± 1.7 blastomeres and 13.5% ± 9.5% vs. 18.3% ± 14.6% fragmentation rate; respectively, P < 0.0001). Autologous endometrial cells were found to elaborate IL-4sR, IL-6, IL-10, IL-15, FGFb, IGFBP-3, TGF-ß2, sL-Selectin, sE-Cadherin, sICAM-1, and sFas, as the levels of these factors were significantly higher in the supernatants from AECC cells compared to conventional media. However, exposure or non-exposure to an embryo did not result in differing levels of these factors in the supernatants of AECC. Also, whereas exposure or non-exposure to an embryo did not result in differing levels of EGF, IGF-I and PDGF-AB in the supernatants of AECC, significantly higher levels of these factors were determined in the conventional media alone. On the other hand, there was no statistical significant difference in the concentrations of FasL, IL-3 and IL-5 in the supernatants from AECC cells exposed or not-exposed to human embryos and from the conventional medium, whereas IL-2 and IL-4 concentrations in the supernatants from AECC cells exposed or not-exposed to human embryos and from the conventional medium were found to be less than the detectable limitations of the assays. Detailed analysis revealed that several of these factors correlated significantly with embryonic development and IVF outcome. Specifically, higher levels of IL-4sR, TGF-ß2, FGFb, IGFBP-3 and lower levels of IL-15, sFas in the supernatants of endometrial cells exposed to human embryos were found to be predictive of improved embryo quality as they correlated significantly with a higher mean number of blastomeres per embryo, lower fragmentation rates and better embryo grade. Similarly, higher levels of IL-4sR, FGFb, IGF-I, IGFBP-3, sL-Selectin and lower levels of EGF, sFas in the supernatants of endometrial cells exposed to human embryos were found to be associated with higher implantation rates and/or improved pregnancy outcome. Furthermore, a direct positive linear correlation was found between sICAM-1 levels and sL-Selectin levels in the supernatants from AECC cells exposed to human embryos (r=.45; P<0.001). Of the 207 pregnancies achieved, 64.7% ended in normal delivery, 18.4% in a miscarriage, 15.9% were biochemical pregnancies, whereas 2 (1%) were ectopic pregnancies. Maternal age remained the most important predictor of outcome, as the clinical pregnancy rate decreased and the miscarriage rate increased with increasing patient’s age.Conclusion: A significant improvement in embryo quality was demonstrated in our study when using autologous endometrial co-culture compared to conventional media. Furthermore, our results show that patients with a poor prognosis secondary to prior IVF failures may have a good outcome when utilizing AECC. The elaboration of a large repertoire of different interleukins, growth factors, adhesion molecules and apoptotic signals by the cells in the AECC, and most importantly, the demonstration of a correlation between their concentration in the AECC following exposure to an embryo with embryo development, implantation, and pregnancy outcome indicates that many different growth regulators may act in concert to orchestrate optimal embryo quality and implantation. Based on these findings, it appears that the autocrine and paracrine interactions between the embryo and its culture environment may play a significant role enhancing embryo quality and possibly improving pregnancy rates in IVF.

Στόγοι me Μελέτης: Η συνκαλλιέργεια ανθρώπινων εμβρύων με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου έχει δειχθεί να βελτιώνει σημαντικά τα αποτελέσματα ασθενών με ιστορικό πολλαπλών προηγούμενων αποτυχημένων προσπαθειών θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης. Υποστηρίζεται ότι η θετική αυτή δράση ασκείται διαμέσου της παραγωγής και απελευθέρωσης ποικίλων τροφικών παραγόντων από τις βοηθητικές αυτές κυτταρικές γραμμές. Τα ενδομητριακά κύτταρα απελευθερώνουν κυτταροκίνες και παράγοντες αναπτύξεως. Ερευνες σε πειραματόζωα, έδειξαν ότι η έκφραση κυτταροκινών και παραγόντων αναπτύξεως από τα κύτταρα του ενδομήτριου συσχετίζεται με την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Ο κύριος στόχος της μελέτης αυτής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της συνκαλλιέργειας με αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα στη ποιότητα των εμβρύων και στα αποτελέσματα της θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης σε ασθενείς με ιστορικό πολλαπλών προηγούμενων αποτυχημένων προσπαθειών και η συσχέτιση των αποτελεσμάτων με τα επίπεδα των κυτταροκινών στα υπερκείμενα των μέσων καλλιέργειας εμβρύων που αναπτύχθηκαν σε σύστημα συνκαλλιέργειας με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου.Σγεδιασμός: Πρωτότυπη προοπτική ερευνητική εργασία.Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά, τριακόσιες-εβδομήντα τρεις ασθενείς με μέσο όρο ηλικίας τα 37.3 ± 3.9 έτη και με ιστορικό 3.0 + 1.8 προηγούμενων αποτυχημένων προσπαθειών θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης εγγράφηκαν με προοδευτικό τρόπο στη μελέτη αυτή. Ολοι οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε βιοψία του ενδομήτριου κατά την ωχρή φάση (τουλάχιστον 5 ημέρες μετά την ανίχνευση της απότομης ανόδου της ωχρινοτρόπου ορμόνης, LH) ενός φυσιολογικού (χωρίς οποιαδήποτε ορμονική θεραπευτική αγωγή) εμμηνορυσιακού κύκλου, πριν από την εφαρμογή θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποιήσεως. Τα αδενικά αλλά και τα κύτταρα στρώματος από το ενδομήτριο απομονώθηκαν με ειδική ενζυματική επεξεργασία και διαχωρίστηκαν με βάση διαφορετικούς χρόνους καθίζησης. Στη συνέχεια τα κύτταρα αυτά καλλιεργήθηκαν μέχρι να επιτευχθεί συρροή των κυττάρων, τα οποία ακολούθως αποδεσμεύθηκαν και στη συνέχεια διατηρήθηκαν στη κρυοκατάψυξη μέχρι την πραγματοποίηση του κύκλου θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης. Οι ασθενείς ακολούθως τέθηκαν κάτω από θεραπευτική αγωγή πρόκλησης ωορρηξίας χρησιμοποιώντας ένα από τα συνήθη πρωτόκολλα πρόκλησης ωορρηξίας και εφαρμόστηκε σε αυτές θεραπεία εξωσωματικής γονιμοποίησης και μεταφορά εμβρύων. Μετά την ανάληψη των ωαρίων και τη γονιμοποίηση, τα έμβρυα τοποθετήθηκαν με τυχαίο τρόπο για ανάπτυξη είτε στη συνκαλλιέργεια με αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα είτε σε συμβατικό μέσο καλλιέργειας εάν περισσότερα από έξι (6) ωάρια είχαν φυσιολογικά γονιμοποιηθεί. Στις περιπτώσεις εκείνες που υπήρχαν 6 ή λιγότερα φυσιολογικώς γονιμοποιημένα ωάρια, τότε όλα τα έμβρυα τοποθετούνταν για ανάπτυξη στη συνκαλλιέργεια. Κατά τη μεταφορά εμβρύων, τα υπερκείμενα από τα μέσα καλλιέργειας που περιείχαν τις συνκαλλιέργειες με αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα μετά από ή και χωρίς έκθεση σε ανθρώπινα έμβρυα περισυλλέγηκαν και αναλύθηκαν για την παρουσία ιντερλευκινάν (IL-2, IL-3, IL-4, IL-4sR, ILS, IL-6, IL-10, IL-15), παραγόντων ανάπτυξης [fibroblast growth factor basic (FGFb), insulin-like growth factor-I (IGF-I), insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3), transforming growth factor beta 2 (TGF-ß2), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor-AB (PDGF-AB), platelet- derived growth factor-BB (PDGF-BB)], μορίων προσκόλλησης [soluble L-Selectin (sL- Selectin), soluble E-Cadherin (sE-Cadherin), soluble Intercellular Adhesion Molecule-1 (sICAM-1)], όπως και σηματοδοτών απόπτωσης [soluble Fas (sFAS), Fas Ligand (FasL)] και τα επίπεδα αυτών συσχετίσθηκαν με το αποτέλεσμα. Επίπεδα των παραγόντων αυτών καταμετρήθηκαν, επίσης, στο συμβατικό μέσο καλλιέργειας (C-2 media συμπληρωμένο με 15% ορό ασθενούς). Οι μετρήσεις των επιπέδων των παραγόντων αυτών πραγματοποιήθηκε με τη χρησιμοποίηση εμπορικά διαθέσιμων τεχνικών αναλύσεων που βασίζονται στη μέθοδο ELISA (sandwich enzyme-linked immunosorbent assays). Η στατιστική ανάλυση περιλάμβανε την εφαρμογή των μεθόδων Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney U test και Chi-square.Αποτελέσματα: Συνολικά, κατά μέσο όρο λήφθηκαν 10.6 + 4.8 ωάρια κατά την ανάληψη ωαρίων και 3.6 ±1.2 έμβρυα μεταφέρθηκαν πίσω στη μήτρα. Το ολικό ποσοστό κυήσεων και ποσοστό κλινικών κυήσεων ήταν 55.5% και 46.1%, αντίστοιχα και το ποσοστό εμφυτεύσεως εμβρύων ήταν 16.1%. Την 3η ημέρα μετά την ανάληψη ωαρίων διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική βελτίωση στην ποιότητα των εμβρύων, όπως εκφράστηκε με τον ανώτερο αριθμό των βλαστομεριδίων και την μείωση του ποσοστού κλασματοποίησης, στα έμβρυα που τοποθετήθηκαν για ανάπτυξη στη συνκαλλιέργεια με αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα σε σύγκριση με τα έμβρυα που τοποθετήθηκαν για ανάπτυξη στο συμβατικό μέσο καλλιέργειας (5.7 ± 1.3 vs. 5.2 ±1.7 βλαστομερίδια και 13.5% ± 9.5% vs. 18.3% ± 14.6% ποσοστό κλασματοποίησης αντίστοιχα, Ρ < 0.0001). Ανάλυσης των υπερκειμένων από όλα τα μέσα καλλιέργειας εμβρύων έδειξε ότι τα αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα εκκρίνουν τους IL-4sR, IL-6, IL-10, IL-15, FGFb, IGFBP-3, TGF-ß2, sL-Selectin, sE-Cadherin, sICAM-1 και sFas, καθώς τα επίπεδα των παραγόντων αυτών ήταν σημαντικά ανώτερα στα υπερκείμενα των συνκαλλιεργειών με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου σε σύγκριση με τα υπερκείμενα από το συμβατικό μέσο καλλιέργειας. Ομως, η έκθεση ή μη σε ανθρώπινα έμβρυα δεν είχε ως αποτέλεσμα την μέτρηση διαφορετικών επιπέδων των κυτταροκινών αυτών στα υπερκείμενα που προέρχονταν από τις συνκαλλιέργειες αυτόλογων ενδομητριακών κυττάρων. Επίσης, ενώ η έκθεση ή μη σε έμβρυο δεν είχε ως αποτέλεσμα την παρουσία διαφορετικών επιπέδων των EGF, IGF-Ι και PDGF-AB στα υπερκείμενα από τις συνκαλλιέργειες, σημαντικά ανώτερα επίπεδα των παραγόντων αυτών διαπιστώθηκαν στο συμβατικό μέσο καλλιέργειας. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε ότι αφορά τα ποσοστά ανιχνεύσεως και συγκεντρώσεις των FasL, IL-3 και IL-5 στα υπερκείμενα των μέσων καλλιέργειας που προέρχονταν από συνκαλλιέργεια αυτόλογων ενδομητριακών κυττάρων μετά από ή και χωρίς έκθεση σε ανθρώπινα έμβρυα, όπως και στα υπερκείμενα από το συμβατικό μέσο καλλιέργειας, ενώ τα επίπεδα της IL-2 και IL-4 στα υπερκείμενα των μέσων καλλιέργειας που προέρχονταν από συνκαλλιέργεια αυτόλογων ενδομητριακών κυττάρων μετά από έκθεση ή μη σε ανθρώπινα έμβρυα, όπως και στα υπερκείμενα από το συμβατικό μέσο καλλιέργειας βρέθηκαν να είναι χαμηλότερα από τις ανιχνευτικές δυνατότητες της τεχνικής ELISA. Λεπτομερής ανάλυση κατέδειξε σημαντική συσχέτιση αρκετών από τους παράγοντες αυτούς με την ανάπτυξη των εμβρύων και το αποτέλεσμα της θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης. Ειδικότερα, υψηλότερα επίπεδα των IL-4sR, TGF-ß2, FGFb, IGFBP-3 και χαμηλότερα επίπεδα των IL-15, sFas στα υπερκείμενα των συνκαλλιεργειών με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου μετά από έκθεση σε ανθρώπινα έμβρυα προδιαθέτανε για βελτιωμένη ποιότητα των εμβρύων αφού διαπιστώθηκαν να συσχετίζονται κατά σημαντικό τρόπο με ανώτερο μέσο αριθμό βλαστομεριδίων ανά έμβρυο, χαμηλότερο ποσοστό κλασματοποίησης και καλύτερο εμβρυϊκό σκορ. Παρόμοια, υψηλότερα επίπεδα των IL- 4sR, FGFb, IGF-I, IGFBP-3, sL-Selectin και χαμηλότερα επίπεδα των EGF, sFas στα υπερκείμενα των συνκαλλιεργειών με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου μετά από έκθεση σε ανθρώπινα έμβρυα βρέθηκαν να συσχετίζονται με ανώτερα ποσοστά εμφυτεύσεως εμβρύων ή/και καλύτερη έκβαση κυήσεων. Ακόμη, τα επίπεδα τού sICAM-1 και τού sL- Selectin στα υπερκείμενα των συνκαλλιεργειών με αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα πού είχαν εκτεθεί σε ανθρώπινα έμβρυα βρέθηκαν να έχουν άμεση θετική γραμμική συσχέτιση (r=.45; Ρ<0.001). Από τις 207 κυήσεις που επιτεύχθηκαν, 64.7% κατέληξαν σε φυσιολογικό τοκετό, 18.4% σε αποβολή, 15.9% ήταν βιοχημικές κυήσεις ενώ 2 κυήσεις (1%) ήταν έκτοπες κυήσεις. Η μητρική ηλικία ήταν ο πιο σημαντικός παράγοντας που καθόρισε το αποτέλεσμα καθώς το ποσοστό κλινικών κυήσεων μειώθηκε και το ποσοστό αποβολών αυξήθηκε με την αύξηση της ηλικίας, καταδεικνύοντας έτσι μείωση στην ποιότητα των ωαρίων/εμβρύων καθώς η ηλικία των ασθενών αυξανόταν.Συμπέρασμα: Με βάση τα ευρήματα της Διατριβής αυτής, παρουσιάζεται μία σημαντική βελτίωση στην ποιότητα των εμβρύων με την εφαρμογή της συνκαλλιέργειας με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου σε σύγκριση με το συμβατικό μέσο καλλιέργειας. Ακόμη, τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν ότι ασθενείς με κακή πρόγνωση συνέπεια πολλαπλών προηγούμενων αποτυχημένων προσπαθειών θεραπείας εξωσωματικής γονιμοποίησης, μπορούν να έχουν βελτιωμένο αποτέλεσμα με τη χρησιμοποίηση της συνκαλλιέργειας με αυτόλογα κύτταρα ενδομήτριου. Η παραγωγή και απελευθέρωση ενός μεγάλου ρεπερτορίου από διαφορετικές ιντερλευκίνες, παράγοντες αναπτύξεως, μορίων προσκόλλησης και σηματοδοτών απόπτωσης από τα αυτόλογα ενδομητριακά κύτταρα στη συνκαλλιέργεια και ακόμη mo σημαντικό, η παρουσίαση μίας συσχέτισης ανάμεσα στις συγκεντρώσεις τους στη συνκαλλιέργεια μετά από έκθεση σε ανθρώπινο έμβρυο με την εμβρυϊκή ανάπτυξη, εμφύτευση και την έκβαση των κυήσεων καταδεικνύει ότι διάφοροι ρυθμιστές αναπτύξεως μπορεί να δρουν ταυτόχρονα για να πετύχουν ικανοποιητική ανάπτυξη και εμφύτευση του εμβρύου. Με βάση τα αποτελέσματα και συμπεράσματα που εξάχθηκαν από τη Διδακτορική αυτή Διατριβή, μπορεί να προταθεί ότι οι αυτοκρινικές και παρακρινικές αλληλεπιδράσεις που υπάρχουν ανάμεσα στο έμβρυο και στο περιβάλλον καλλιέργειας του, ασκούν θετική επίδραση ενισχύοντας έτσι την ποιότητα του εμβρύου και κατά συνέπεια βελτιώνοντας τα ποσοστά κυήσεων μετά από θεραπεία εξωσωματικής γονιμοποίησης.