Μοριακή σταδιοποίηση στο κακοήθες μελάνωμα

Abstract

A highly sensitive method for the detection of circulating melanocytes in patients with malignant melanoma has recently been described and confirmed. The application RT-PCR for the detection of Tyr-mRNA is based on the fact that the Tyr gene encoding for the key enzyme in melanin biosynthesis is actively expressed by melanocytic cells. Although the assay sensitivity can theoretically detect a single tumor cell among 10,000,000 normal cells, there are considerable variations in the stage related detection rates. The purpose of this study was to examine if there is a correlation between a positive assay result and known prognostic melanoma criteria, such as Clinical stage, Breslow thickness, Clark level, gender and histologic tumor type.We tested blood samples from 78 patients aged 30-82 years with malignant melanoma of all clinical stages (stage I: n=10, stage II: n=19, stage III: n=37, stage IV: n=12) for the expression of Tyr. Of the 78 patients whose total RNA was subjected to RT-nested_PCR for Tyr expression, 20 were found to be positive (25.6%). Positive results were also obtained in 1/10 (10%) of stage I patients, 3/19 (15.8%) of stage II patients, 9/37 (24.3%) of stage III patients and 7/12 (58.3%) of stage IV patients. This showed a clear stage correlation positivity and a remarkable correlation between the metastatic disease and the detection of circulating Tyr-mRNA positive cells (p:0.010). Furthermore, the probability of a positive result was found to be 5.33 times higher in metastatic patients than in patients with no distant métastasés. Our results are in agreement with other studies describing approximately 20%-60% positive PCR results in patients with distant métastasés. Barring the gender, no statistically significant correlation between other prognostic factors and positive RT-PCR exists. A remarkably higher percentage of female patients tested positive for Tyr compared to male patients. Overall, a positive RT-PCR was observed in 3 out of 32 (9.4%) male patients as compared to 17 out of 46 (37.9%) female patients (p:0.008). Contrary to previous studies that reported a higher percentage of tyrosinase positive males, our study shows the opposite, whereby females show a 3.9 fold increased probability of testing positive for Tyr than males. However, our analysis did not suggest the gender as an independent statistic variable, so the high Tyr positive rates of females cannot significantly be estimated of clinical value. In cases where the tumor thickness was greater than 4mm and the Clark level was equal to V, as in the cases of stage IV patients, we found a higher percentage of patients tested positive for Tyr.The clinical value of detection of circulating melanocytes has been investigated by several groups, with reported conflicting results. The limited number of cases in most of the previous studies and the different méthodologie approaches to sample preparation might account for the contrasting results on the reliability of the RT-PCR assay to test tumor progression in malignant melanoma patients.As a conclusion, our study demonstrates a significant correlation of metastatic disease with Tyr-PCR positive results. It is of great clinical value, since the assay can be routinely used as a follow up progression marker for early detection of hematogenous dissemination risk.

Μια υψηλής ευαισθησίας μέθοδος ανίχνευσης κυκλοφορούντων μελανοκυττάρων σε ασθενείς με κακοήθες μελάνωμα έχει πρόσφατα περιγράφει. Η εφαρμογή της RT-PCR για την ανίχνευση της Tyr-mRNA βασίζεται στο γεγονός, ότι το γονίδιο της τυροσινάσης, ενζύμου - κλειδί στη βιοσύνθεση της μελανίνης, απαντά αποκλειστικά στα μελανοκύτταρα. Αν και σύμφωνα με την υψηλή ευαισθησία της, η δοκιμασία θεωρητικά ανιχνεύει ένα καρκινικό κύτταρο μεταξύ ΙΟ6 φυσιολογικών κυττάρων, έχουν περιγράφει ποίκιλλα αποτελέσματα στα ανιχνεύσιμα ποσοστά σε σχέση με το κλινικό στάδιο. Σκοπός αυτής της μελέτης είναι να εξετάσει εάν υπάρχει συσχέτιση της θετικής Tyr-RT- PCR με γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες του μελανώματος, όπως είναι το κλινικό στάδιο, το πάχος κατά Breslow, το επίπεδο διήθησης κατά Clark, το φύλο και τον ιστολογικό τύπο του όγκου.Αναλύσαμε δείγματα αίματος από 78 ασθενείς ηλικίας από 30 έως 82 ετών με κακοήθες μελάνωμα όλων των κλινικών σταδίων (stage 1:10, stage 11:19, stage 111:37, stage IV:12) για την έκφραση της τυροσινάσης. Από τους 78 ασθενείς 20 βρέθηκαν θετικοί στη δοκιμασία (25.6%). Αναλυτικά, θετικά αποτελέσματα βρέθηκαν σε 1/10 (10%) ασθενείς σταδίου I, σε 3/19 (15.8%) ασθενείς σταδίου II, σε 9/37 (24.3%) ασθενείς σταδίου III και σε 7/12 (58.3%) ασθενείς σταδίου IV. Τα αποτελέσματα αυτά κατέδειξαν σαφή κλιμάκωση της θετικότητας με την άνοδο του κλινικού σταδίου, όπως κι αξιοσημείωτη συσχέτιση των μεταστατικών ασθενών με την ανίχνευση κυκλοφορούντων κυττάρων με θετική έκφραση Tyr-mRNA (ρ:0.010). Επιπρόσθετα στους μεταστατικούς ανευρέθηκε πιθανότητα θετικού αποτελέσματος 5.33 φορές μεγαλύτερη από ότι στους ασθενείς χωρίς απομακρυσμένες μεταστάσεις. Τα ανωτέρω αποτελέσματα έρχονται σε απόλυτη συμφωνία με αντίστοιχα προγενέστερων μελετών. Με εξαίρεση το φύλο δεν ανευρέθηκε κάποια άλλη συσχέτιση της θετικής δοκιμασίας με άλλους προγνωστικούς παράγοντες. Σε αντίθεση με παρόμοιες μελέτες, η παρούσα μελέτη κατέδειξε επικράτηση των θετικών αποτελεσμάτων στις γυναίκες, οι οποίες παρουσίασαν κατά 3.9 φορές αυξημένη πιθανότητα θετικού αποτελέσματος σε σχέση με τους άνδρες. Ωστόσο η στατιστική ανάλυση δεν ανέδειξε το φύλο ως ανεξάρτητη στατιστική μεταβλητή. Στις περιπτώσεις όπου το πάχος Breslow ήταν μεγαλύτερο από 4mm και το επίπεδο Clark ίσο ή μεγαλύτερο από V, διαπιστώθηκε αυξημένο ποσοστό θετικής δοκιμασίας.Η ανίχνευση κυκλοφορούντων μελανοκυττάρων έχει μελετηθεί από πολλούς ερευνητές, χωρίς όμως συμφωνία των αποτελεσμάτων τους. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στον περιορισμένο αριθμό των εξεταζόμενων ασθενών ή σε διαφορετικές μεθόδους προετοιμασίας των δειγμάτων αίματος.Συμπερασματικά, σύμφωνα με τη μελέτη μας, υπάρχει σημαντική συσχέτιση του μεταστατικού σταδίου της νόσου με τη θετική Tyr-RT- PCR. Κι αυτό μπορεί να εκληφθεί ως στοιχείο υψηλής κλινικής σημασίας, αφού η δοκιμασία μπορεί σε βάση ρουτίνας, με μια απλή αιμοληψία, να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης για την πρώιμη αναγνώριση του κινδύνου αιματογενούς διασποράς του όγκου.