Κατευθυνόμενη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων: ο ρόλος των επιγενετικών τροποποιήσεων και των αλληλεπιδράσεων χρωματίνης - πυρηνικού φακέλου

Abstract

Lamin B receptor (LBR) is a ubiquitous integral protein of the inner nuclear membrane, consisting of a N-terminal part facing the nucleoplasm, eight transmembrane domains and a small C-terminal tail. The protein interacts with chromatin, lamin B and HP1 and has the ability to form distinct microdomains in the inner nuclear membrane. Main functions of the protein are the preservation of chromatin structure and, perhaps, some role in cholesterol biosynthesis. Mutations of the LBR gene are responsible for major diseases in human and mice. In human embryos, truncation of the LBR protein beyond the seventh transmembrane domain results in Greenberg’s dysplasia, while in mice truncation at the fourth transmembrane domain results in ichthyosis.LBR has often been used as a marker of the inner nuclear membrane and as a reporter of nuclear envelope dynamics. However, what we currently know about the intracellular mobility of this protein is largely based on the properties of a “designer’s mutant”, which shows correct localization, but lacks the carboxy-terminal two-thirds of the molecule. Drawing a distinction from previous studies, we show here that the diffusional mobility of LBR exhibits a striking, region-specific variation, consistent with its non-uniform distribution along the inner nuclear membrane and the apparent asymmetry of the nuclear envelope-endoplasmic reticulum interface. Interestingly, removal of transmembrane domains II-VIII (as in the “designer’s mutant”) lowers significantly the ensemble averaged mobility of LBR at the nuclear envelope, but does not seem to affect LBR dynamics at the endoplasmic reticulum. On the other hand, deletion of transmembrane domains V-VIII or VIII (corresponding to icj and Greenberg mutants) renders the protein hyper-mobile. Recent findings support that during the transition from the undifferentiated to the differentiated state of embryonic stem cells (ESCs), silenced loci attached to the nuclear periphery gradually detach and the corresponding genes are activated. Considering that LBR is directly implicated in the process of differentiation in at least one lineage (neutrophil leucocytes), our aim was to decipher in detail the functional role of the protein during ESCs differentiation. Our data suggest that over-expression of wild type or mutant LBR in embryonic stem cells lowers significantly the dynamic range of Nanog fluctuations, but does not affect the non-differentiated state per se. However, this modest down-regulation of Nanog seems to alter the differentiation potential of the cells. Results from directed differentiation protocols show that cells over-expressing the hyper-mobile LBR mutants exhibit increased cell death and lineage-specific effects. Concluding, we suggest that LBR is important for orderly stem cell differentiation, but in a lineage-specific manner.

Ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη διαμεμβρανική πρωτεΐνη του πυρηνικού φακέλου, που περιλαμβάνει ένα υδρόφιλο αμινοτελικό τμήμα, οκτώ εν σειρά διαμεμβρανικές περιοχές (ΤΜ Ι-VIII) και ένα ουραίο καρβοξυτελικό τμήμα. Η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με την περιφερική ετεροχρωματίνη, και το δίκτυο των πυρηνικών λαμινών, σχηματίζοντας διακριτές «νησίδες» στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Υπάρχουν ενδείξεις ότι ο LBR συμμετέχει στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας του πυρήνα, στη μεταγωγή σήματος, αλλά και στη μεταγραφική απενεργοποίηση μεγάλων γονιδιακών συστοιχιών που είναι συνδεδεμένες με την πυρηνική περιφέρεια (LADs). Λόγω της εντυπωσιακής ομολογίας ανάμεσα στις διαμεμβρανικές περιοχές του LBR και τις αντίστοιχες περιοχές των ενζύμων DHCR14 και DHCR7, δύο αναγωγασών της στερόλης, εικάζεται επίσης ότι η πρωτεΐνη μπορεί να διαδραματίζει κάποιο ρόλο στη βιοσύνθεση της χοληστερόλης. Ποια από αυτές τις υποθέσεις και εικασίες είναι ορθή δεν είναι σαφές προς το παρόν. Παρόλα ταύτα, είναι μάλλον βέβαιο ότι ο LBR εμπλέκεται σε ζωτικής σημασίας λειτουργίες, διότι μεταλλάξεις σε διάφορα τμήματα του μορίου του προκαλούν μείζονες αναπτυξιακές βλάβες και θανατηφόρες νόσους στο ποντίκι και τον άνθρωπο.Για να αποτυπωθούν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας και να αποκαλυφθεί ο κύριος φυσιολογικός ρόλος του LBR, μελετήσαμε συστηματικά την κατανομή και τη δυναμική του αγρίου τύπου μορίου, εν σχέσει προς μεταλλαγμένες μορφές από τις οποίες έχουν αφαιρεθεί διάφορες περιοχές και δομικά μοτίβα. Σε αντιδιαστολή με προηγούμενες εργασίες, διαπιστώθηκε ότι η δυναμική τόσο της αγρίου τύπου πρωτεΐνης όσο και των μεταλλαγμένων μορφών παρουσιάζει μεγάλες διακυμάνσεις από τη μία περιοχή του πυρηνικού φακέλου στην άλλη. Οι διακυμάνσεις αυτές οφείλονται πρωτίστως στην ανομοιογενή κατανομή του LBR κατά μήκος της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, αλλά και στην εμφανή ασυμμετρία της διεπιφάνειας πυρηνικού φακέλου-ενδοπλασματικού δικτύου. Παρά τη δυναμική αυτή «αβεβαιότητα», η σύγκριση των μέσων κινητικών παραμέτρων (ensemble average parameters) που προκύπτουν από την ανάλυση της δυναμικής του LBR σε επίπεδο κυτταρικών πληθυσμών επιτρέπει την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων σε ό,τι αφορά τις διαφορές αγρίου τύπου και μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Παραδείγματος χάρη, παράγωγα του LBR από τα οποία απουσιάζουν οι διαμεμβρανικές περιοχές V-VIII ή μόνο η VIII (όπως στη νόσο ιχθύωση και τη δυσπλασία του Greenberg) είναι κατά μέσο όρο πιο «κινητικά» στον πυρηνικό φάκελο από τον αγρίου τύπου LBR. Αντίθετα, μεταλλαγμένες μορφές από τις οποίες έχουν αφαιρεθεί οι διαμεμβρανικές περιοχές II-VIII, είναι λιγότερο κινητικές από την ακέραια πρωτεΐνη. Για να διαπιστωθεί εάν ο αγρίου τύπου ή ο μεταλλαγμένος LBR επηρεάζουν βασικές λειτουργίες, όπως τη διατήρηση της πολυδυναμίας και την ικανότητα διαφοροποίησης, αναπτύξαμε σειρές εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων ποντικού που εκφράζουν σταθερά τις αντίστοιχες πρωτεΐνες. Στο στάδιο των αδιαφοροποίητων κυττάρων, παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση της αγρίου τύπου πρωτεΐνης μειώνει ελαφρά την έκφραση, αλλά περιορίζει σημαντικά το δυναμικό εύρος των στοχαστικών διακυμάνσεων που υφίσταται ο μεταγραφικός παράγοντας Nanog. Κατ’ αυτό τον τρόπο, σε επίπεδο πληθυσμού, μειώνεται αισθητά το ποσοστό των «αυθεντικά» πολυδύναμων (naïve) βλαστικών κυττάρων και αυξάνεται εκείνο των «κινητοποιημένων» (primed). Κάτι ανάλογο συμβαίνει, σε πολύ μικρότερο όμως βαθμό, μετά από υπερέκφραση των μεταλλαγμένων μορφών LBR. Σειρές βλαστικών κυττάρων που εκφράζουν την αγρίου τύπου ή τις «υπερ-κινητικές» μορφές της πρωτεΐνης αδυνατούν να αναπτυχθούν φυσιολογικά και εμφανίζουν ιστο-ειδικές αποκλίσεις όταν επάγεται η στοχευμένη διαφοροποίησή τους προς καρδιο-μυοκύτταρα ή νευρωνικά κύτταρα. Εν τούτοις, ενώ οι σειρές που εκφράζουν αγρίου τύπου LBR επιβιώνουν για αρκετές ημέρες μετά την απόσυρση του παράγοντα επιβίωσης LIF από τα θρεπτικά μέσα, όλες οι σειρές που εκφράζουν τα κολοβωμένα μεταλλάγματά του υφίστανται μαζικό θάνατο. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, προκαταρκτικά δεδομένα που προέρχονται από τη μελέτη επαναπρογραμματισμένων ινοβλαστών προς βλαστικά κύτταρα (iPS cells) υποδηλώνουν ότι οι επιδράσεις της υπερέκφρασης του LBR και της αλλαγής στην αρχιτεκτονική του είναι διακριτά φαινόμενα.