Μελέτη της μεθυλίωσης του υποκινητού του γονιδίου του p16INK4A στο σποραδικό μελάνωμα

Abstract

The aim of this study was to estimate the frequency and the importance of p16INK4A promoter methylation in the development of sporadic melanoma in the Greek population. Peripheral blood from 100 patients and tissue samples from 72 patients with possible cutaneous melanoma who visited "Andreas Syggros" hospital between 2010 and 2013 were used for this study. For the research of p16INK4A promoter methylation, DNA was extracted from lymphocytes of peripheral blood and tissue samples and underwent bisulfite treatment. p16INK4A promoter methylation was analyzed by methylation specific PCR. PCR products were separated on 1.6% agarose gels stained with ethidium bromide and visualized under UV light. DNA sequencing was performed. Immunohistochemical analysis of p16INK4A protein expression and Ki-67 was also performed. Afterwards, statistical analysis of results was performed.58 out of 72 tissue samples were melanomas and 14 were dysplastic or non-dysplastic nevi. Clinicopathologic features were studied. p16INK4A promoter methylation was detected in 4% (4 out of 100) of examined blood samples and in 25,86% of examined melanoma tissue samples. The frequency of p16INK4A promoter methylation in tissue samples was higher in melanomas that were in vertical growth phase and in those displaying epidermal involvement. The presence of p16INK4A promoter methylation was correlated with increased melanoma thickness (Breslow index) and with increased Clark level. p16INK4A immunoreactivity was observed in 40 of 54 (74,07%) of the examined cases. The presence of p16INK4A immunoreactivity was marginally correlated with the presence of tumor lymphocytic infiltration. Ki-67 staining was available in 40 cases and varied from 0 to 40% (median value 7%). High Ki-67 index was correlated with p16INK4A promoter methylation. In conclusion, we found an important percentage of p16INK4A promoter methylation in Greek patients with sporadic melanoma. Transcriptional silencing of p16INK4A seems to be correlated with increased cell proliferation and loss of cell cycle control, with more aggressive tumors and melanoma progression. p16INK4A seems to play an important role in melanoma development probably by cell cycle deregulation.

Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της συχνότητας και της σημασίας της απενεργοποίησης του γονιδίου p16INK4A στην ανάπτυξη σποραδικού μελανώματος στον ελληνικό πληθυσμό. Λήφθηκαν 100 δειγματα περιφερικού αίματος και 72 δείγματα βιοπτικού υλικού από ασθενείς με πιθανό σποραδικό μελάνωμα που επισκέφθηκαν το νοσοκομείο ¨Ανδρέας Συγγρός¨ απ’το 2010 ως το 2013. Πραγματοποιήθηκε ανίχνευση της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου p16INK4A. Το DNA απομονώθηκε από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και από βιοπτικό υλικό. Επωάστηκε με δισουλφιδικό νάτριο και πραγματοποιήθηκε PCR με μεθυλιωμένους και μη μεθυλιωμένους εκκινητές. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση του DNA σε πήκτωμα αγαρόζης και αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του p16INK4A και του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67 και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Από τα 72 δείγματα ιστού τα 58 ήταν μελανώματα και 14 κοινοί μελαγχρωματικοί ή δυσπλαστικοί σπίλοι. Μελετήθηκαν κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά. Στα 100 δείγματα περιφερικού αίματος ανιχνεύθηκαν 4 μεθυλιώσεις ενώ στα 58 δείγματα περιφερικού ιστού ανιχνεύθηκαν 15 μεθυλιώσεις (25,86%). Από τη μελέτη των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών παρατηρήθηκε συσχέτιση της μεθυλίωσης του υποκινητή του p16INK4A με τα μελανώματα που βρίσκονται σε κάθετη φάση ανάπτυξης, εκείνα που παρουσιάζουν διήθηση της επιδερμίδας, αυξημένο πάχος όγκου και αυξημένο επίπεδο διήθησης κατά Clark. Η πρωτεϊνική έκφραση του p16INK4A ήταν θετική σε 40 από τα 54 δείγματα. Διαπιστώθηκε οριακή συσχέτιση μεταξύ της θετικής έκφρασης του p16INK4A και της παρουσίας λεμφοκυτταρικής διήθησης. Η μελέτη του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki-67 πραγματοποιήθηκε σε 40 από τα 58 δείγματα. Οι τιμές του κυμάνθηκαν από 0 ως 40% με μέση τιμή το 7%. Επιπλέον παρατηρήθηκε συσχέτιση των υψηλών επιπέδων Ki-67 με τη μεθυλίωση του υποκινητή του p16INK4A.Συμπερασματικά παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικό ποσοστό μεθυλίωσης του υποκινητή του p16INK4A σε δείγματα σποραδικού μελανώματος στον Ελληνικό πληθυσμό. Η απενεργοποίηση του p16 φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και συνεπώς με απώλεια ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, με περισσότερο επιθετικούς όγκους και με προχωρημένη νόσο όπως επιβεβαιώνεται και από τις συσχετίσεις με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά. Το p16INK4A λοιπόν φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του μελανώματος, πιθανώς μέσω απορρύθμισης του κυτταρικού κύκλου.