Ανάπτυξη εκλεκτικών ψευδοπεπτιδικών αναστολέων μεταλλοενζύμων με τη χρήση συνδυασμικής χημείας

Abstract

Zinc-metalloproteases constitute a many-member family of poteolytic enzymes. Neutral Endopeptidase 24-11 (ΝΕΡ), Endothelin Converting Enzymes (ECE) and Angiotensin I Converting Enzyme (ACE) are some enzymes, which belong to this family. These enzymes comprise the subfamily of vasopeptidases that are mainly involved in the regulation of the cardiovascular system. Matrixins constitute another important subfamily, which belongs to the super-family of zinc-metalloproteases. These enzymes are structurally and functionally related to a great deal, and moreover, they play an important role in both normal and pathological conditions (e.g. wound healing, bone development, angiogenesis, arthritis, tumor-associated metastasis etc.). Over the last decade, many scientific groups have focused their interest on the development of inhibitors of these enzymes, in order to elucidate their action mechanisms and, therefore, to face pathological conditions. Indeed, many inhibitors of the above-mentioned enzymes are currently under clinical trials or are constituents of diverse therapeutic agents (especially in the field of the vasopeptidases, as anti-hypertensive agents). Nevertheless, the discovery of potent and selective inhibitors of these enzymes is a highly scientifically attractive project, since it is in its infancy, especially in the field of matrixins. Phosphinic pseudopeptides represent an important class of transition-state analogs that have proved to be effective inhibitors of a variety of zinc-metalloproteases. However, their synthesis consists of several steps and is absolutely dependent on the availability of the starting materials. Moreover, a literature search revealed that most of the reported phosphinic peptides generally involve “simple” amino acids that lack side-chain functionality (e.g. phenylalanine, alanine, valine etc.). The fact that the side chain of the P1΄ position of phosphinic inhibitors is one of the key side chains for the control of inhibitor potency and selectivity, interacting with the S1΄ subsite of metalloenzymes (especially with that of matrixins), has provided an approach for designing MMPs inhibitors by incorporating non-natural side chains of broad chemical diversity in this position. Systematic investigation of the influence of such side chains of phosphinic inhibitors on their activity could elucidate structure-activity relationships. The present study consists of the following: 1) The development of a synthetic methodology, which will allow the diversification, mainly of the Ρ1΄ position of phosphinic inhibitors, using a molecular template, which can be diversified at the final step of the synthesis. In particular, the introduction of the heterocyclic ring of substituted isoxazoline, into this position, was studied. To this end, phosphinic dipeptides and tripeptides, with an unsaturated C-C system (double bond) in the desired position, were prepared. Then, the introduction of the isoxazoline rings was accomplished, in the final synthetic step, by application-for the first time in the phosphinic peptide filed-of an important reaction of the Organic Chemistry, that is 1,3-dipolar cycloaddition reactions (DCRs) of nitrile oxides. The synthesis of the isoxazoline-phosphinic peptides was carried out in solution phase, while the development of the desired phosphinic inhibitors (tripeptides) was based on the results of previous studies, which demonstrated that the compound RXP03 is a potent inhibitor of many MMPs. 2) The development of an analog methodology for the introduction of the heterocyclic rings of substituted isoxazole into the Ρ1΄ position of phosphinic tripeptides. To this end, optically pure phosphinic tripeptides, with an unsaturated C-C system (triple bond) in the desired position, were prepared. Then, the introduction of the isoxazole ring was accomplished, in the final synthetic step, by application of 1,3-dipolar cycloaddition reactions (DCRs) of nitrile oxides. ..............................

Οι μεταλλοπρωτεάσες ψευδαργύρου αποτελούν μια πολυμελή οικογένεια πρωτεολυτικών ενζύμων. Σε αυτή την οικογένεια ανήκουν, μεταξύ άλλων, τα ένζυμα ουδέτερη ενδοπεπτιδάση 24-11 (ΝΕΡ), τα μετατρεπτικά ένζυμα ενδοθηλίνης (ECE) και το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης Ι (ACE). Τα ένζυμα αυτά συνιστούν την υποοικογένεια των αγγειοπεπτιδασών και εμπλέκονται ενεργά στη ρύθμιση του καρδιαγγειακού συστήματος. Μια άλλη σημαντική υποοικογένεια των ψευδαργυρο-πρωτεασών είναι οι ματριξίνες. Τα ένζυμα αυτά παρουσιάζουν αξιοσημείωτη δομική και λειτουργική αναλογία, και εμπλέκονται σε πλήθος φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων (π.χ. επούλωση τραυμάτων, ανακατασκευή οστών, αγγειογένεση, αρθρίτιδα, μετάσταση καρκινικών κυττάρων κ.ά.). Η ανάπτυξη αναστολέων αυτών των ενζύμων έχει αποτελέσει αντικείμενο επισταμένης έρευνας τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την αποσαφήνιση των μηχανισμών δράσης τους και, ως εκ τούτου, την δυνατότητα αντιμετώπισης παθολογικών καταστάσεων. Πράγματι, πολλοί αναστολείς των παραπάνω ενζύμων βρίσκονται αυτή τη στιγμή σε στάδιο κλινικών δοκιμών ή αποτελούν ενεργά συστατικά φαρμακευτικών μέσων (ειδικά στον τομέα των αγγειοπεπτιδασών, ως αντιυπερτασικά μέσα). Ωστόσο, η ανάπτυξη νέων ισχυρών αλλά και εκλεκτικών αναστολέων αυτών των ενζύμων αποτελεί ενδιαφέρουσα ερευνητικά πρόταση, καθώς δεν έχει προχωρήσει στον επιθυμητό βαθμό, ειδικά στο πεδίο των ματριξινών. Τα φωσφινικά ψευδοπεπτίδια έχει αποδειχτεί ότι αποτελούν μια σημαντική τάξη αναστολέων πολλών μεταλλοενζύμων, δρώντας ως ανάλογα μεταβατικής κατάστασης. Ωστόσο, η σύνθεση και ανάπτυξή τους είναι μια πορεία πολλών σταδίων και συχνά περιορίζεται από τη διαθεσιμότητα των πρώτων υλών. Επιπλέον, τα μέχρι τώρα βιβλιογραφικά δεδομένα δεν έχουν παρά να επιδείξουν, στις περισσότερες των περιπτώσεων, την ανάπτυξη φωσφινικών ψευδοπεπτιδικών μονάδων οι οποίες αποτελούνται από ανάλογα “απλών” φυσικών αμινοξέων (π.χ. φαινυλαλανίνη, αλανίνη, βαλίνη κ.ά.) και στερούνται λειτουργικών ομάδων στις πλευρικές αλυσίδες. Το γεγονός ότι η ομάδα της Ρ1΄ θέσης των φωσφινικών αναστολέων είναι πολύ σημαντική για την εκδήλωση, όχι μόνο ισχυρής, αλλά και εκλεκτικής ενζυμικής δράσης, αλληλεπιδρώντας με την S1΄ υποπεριοχή των μεταλλοενζύμων (ιδιαίτερα των ματριξινών), έχει οδηγήσει στην ιδέα σχεδιασμού αναστολέων που φέρουν στη συγκεκριμένη θέση μη φυσικές πλευρικές αλυσίδες, ποικίλης χημικής σύστασης. Η συστηματική μελέτη της επίδρασης τέτοιων πλευρικών αλυσίδων στη δράση των φωσφινικών αναστολέων αναμένεται να οδηγήσει σε συμπεράσματα για τη σχέση δομής-δραστικότητας. Έτσι, η εργασία αυτή είχε ως αντικείμενο: 1) Την ανάπτυξη συνθετικής μεθοδολογίας, η οποία να επιτρέπει τη χημική διαφοροποίηση, κυρίως της Ρ1΄ θέσης, φωσφινικών πεπτιδίων, χρησιμοποιώντας ένα βασικό μόριο-κορμό, με μία αντίδραση, στο τελικό στάδιο της σύνθεσης. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η εισαγωγή ετεροκυκλικών δακτυλίων υποκατεστημένης ισοξαζολίνης στην εν λόγω θέση. Με αυτό το σκοπό, παρασκευάστηκαν φωσφινικά διπεπτίδια και τριπεπτίδια που έφεραν ακόρεστο σύστημα C-C (διπλό δεσμό) στην επιθυμητή θέση. Κατόπιν, η εισαγωγή των ισοξαζολινικών δακτυλίων επιτεύχθηκε, στο τελικό στάδιο της σύνθεσης, με εφαρμογή μιας σημαντικής αντίδρασης της οργανικής χημείας, που δεν έχει εφαρμοστεί ως σήμερα στο πεδίο των φωσφινικών πεπτιδίων, δηλαδή της 1,3-διπολικής κυκλοπροσθήκης (DCRs) οξειδίων του νιτριλίου. ............................