Συμβολή στην ανάπτυξη εκλεκτικών φωσφινικών αναστολέων Zn - μεταλλοενζύμων

Abstract

Zinc-metalloproteases constitute a many-member family of proteolytic enzymes.Matrixins constitute another important subfamily, which belongs to the super-family of zincmetaloproteases. These enzymes are structurally and functionally related to a great deal, and moreover, they play an important role in both normal and pathological conditions (e.g wound healing, bone development, atherosclerosis, tumor associated metastasis). Over the last decade, many scientific groups have focused their interest on the development of inhibitors of these enzymes, in order to elucidate their action mechanisms and, therefore, to face pathological conditions. Indeed many inhibitors of the above-mentioned enzymes are currently under clinical trials. Nevertheless, the discovery of potent and selective inhibitors of these enzymes is a highly scientifically attractive project. Phosphinic pseudopeptides represent an important class of matrixins inhibitors which act at transition state analogues of the proteolysis. The rational optimization of their structural features enables the development of potent and highly selective MMPs inhibitors. The fact that the side chain of the P1΄ position of phosphinic inhibitors is very important for the control of inhibitor potency, interacting with the S1΄ subsite of matrixins, has provided an approach for designing MMPs inhibitors by incorporating non-natural side chains of broad chemical diversity in this position. Our lab has developed a synthetic method for phosphinic tripeptides incorporating substituted isoxazole rings at their P1΄ position, which constitute some of the most potent MMPs inhibitors that have been described so far. The extensive research conducted in the field of matrixins has provided valuable information regarding the topology of S1΄ subsite. However the S2 subsite has not been investigated at great length, even if a literature search indicates several cases where inhibitor potency and selectivity is ascribed to the effectiveness of P1-S1 interactions. The first part of the present study consists of the following: The development and the application of a synthetic methodology for the synthesis of isoxazole-phosphinic synthons by 1,3-dipolar cycloaddition reaction, allowing the solid phase synthesis and the construction of four peptidic libraries, in order to study the effectiveness of P1΄, P2΄ and P3΄ positions towards the selectivity of various MMPs. In particular, based on previous studies of structure-activity relationships, we chose four different substituents of the isoxazole ring, which characterized the structural identity of each peptide library. In the other two positions we applied a diversity of natural aminoacids The enzymatic evaluation of the libraries led to the discovery of a new potent and selective inhibitor of MMP-12, tetrapeptide 9 (Ki=0.19nm). Attachment of a bulky substituent on the isoxazole ring and introduction of the aminoacid motif Glu-Glu at the P2΄ and P3΄ positions were the key-elements of improved potency and selectivity towards MMP-12. ....................

Οι μεταλλοπρωτεάσες ψευδαργύρου αποτελούν μια πολυμελή οικογένεια πρωτεολυτικών ενζύμων. Μια σημαντική υποοικογένεια των ψευδαργυροπρωτεασών είναι οι ματριξίνες.Τα ένζυμα αυτά παρουσιάζουν αξιοσημείωτη δομική και λειτουργική αναλογία και εμπλέκονται σε πλήθος φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων (π.χ επούλωση τραυμάτων, ανακατασκευή οστών, αθηροσκλήρωση, σχηματισμός όγκων και μετάσταση καρκινικών κυττάρων). Η ανάπτυξη αναστολέων αυτών των ενζύμων έχει αποτελέσει αντικείμενο επισταμένης έρευνας τις τελευταίες δεκαετίες, με σκοπό την αποσαφήνιση των μηχανισμών δράσης τους και, ως εκ τούτου, τη δυνατότητα αντιμετώπισης παθολογικών καταστάσεων. Πράγματι, πολλοί αναστολείς των παραπάνω ενζύμων βρίσκονται αυτή τη στιγμή σε στάδιο κλινικών δοκιμών. Ωστόσο η ανάπτυξη νέων ισχυρών αλλά και εκλεκτικών αναστολέων αυτών των ενζύμων αποτελεί ενδιαφέρουσα ερευνητική πρόταση. Τα φωσφινικά ψευδοπεπτίδια αποτελούν μια σημαντική κατηγορία αναστολέων των ματριξινών (Matrix Metalloproteinases, MMPs) που δρούν ως ανάλογα της μεταβατικής κατάστασης της πρωτεολυτικής αντίδρασης. Η ορθολογική βελτιστοποίηση των δομικών χαρακτηριστικών τους προσφέρει τη δυνατότητα ανάπτυξης ισχυρών και εξαιρετικά εκλεκτικών αυτών των ενζύμων. Το γεγονός ότι η ομάδα της P1΄ θέσης των φωσφινικών αναστολέων είναι πολύ σημαντική για την εκδήλωση ανασταλτικής δράσης, αλληλεπιδρώντας με την S1΄ υποπεριοχή των ματριξινών, έχει οδηγήσει στο σχεδιασμό αναστολέων που δεν φέρουν στη συγκεκριμένη θέση ανάλογα φυσικών αμινοξέων, αλλά μη φυσικές πλευρικές αλυσίδες, ποικίλης χημικής σύστασης. Από το εργαστήριο μας έχει αναπτυχθεί η μέθοδος σύνθεσης φωσφινικών τριπεπτιδίων που φέρουν ετεροκυκλικούς δακτύλιους υποκατεστημένης ισοξαζόλης στην P1΄ θέση και αποτελούν από τους πιο ισχυρούς αναστολείς ματριξινών που έχουν περιγραφεί. Έτσι ο κύριος όγκος των ενζυμικών προσδιορισμών έχει δώσει πληροφορίες για την S1΄ υποπεριοχή των MMPs. Ωστόσο η S2 περιοχή δεν έχει διερευνηθεί διεξοδικά, αν και έχουν αναφερθεί αρκετές περιπτώσεις όπου η ισχύς και η εκλεκτικότητα αναστολέων αποδίδεται στην ισχυρή αλληλεπίδραση αυτής της υποπεριοχής με την P2 θέση τους. ‘Ετσι το πρώτο μέρος της ερευνητικής εργασίας είχε ως αντικείμενο: Την ανάπτυξη και την εφαρμογή μιας μεθοδολογίας για τη σύνθεση ισοξαζολυλο-φωσφινικών συνθονίων μέσω 1,3-διπολικής κυκλοπροσθήκης ώστε να είναι δυνατή η σύζευξη τους σε στερεά φάση και να παρασκευασθούν τέσσερις πεπτιδικές βιβλιοθήκες, ώστε να μελετηθούν 221 οι P1΄, P2΄ και P3΄ θέσεις στην εκλεκτικότητα αναστολής διαφόρων MMPs. Πιο συγκεκριμένα βάσει προηγούμενων μελετών σχέσης δομής-δραστικότητας, επιλέχθηκαν τέσσερις διαφορετικές πλευρικές αλυσίδες για την 3-θέση του υποκατεστημένου ισοξαζολικού δακτυλίου που αφορούσαν την P1΄ θέση των βιβλιοθηκών, η οποία χαρακτήριζε και την δομική ταυτότητα της κάθε βιβλιοθήκης. Στις άλλες δυο θέσεις υπήρχε ποικιλότητα φυσικών αμινοξέων. Από την ενζυμική αποτίμηση των βιβλιοθηκών προέκυψε για την MMP-12 ο ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας 9 (Ki=0.19nm). .............................